Classement des ligands à haute affinité de faible solubilité par spectroscopie RMN

des paramètres de liaison ligand / récepteur nécessitent des concentrations des deux partenaires de l’ordre de la constante de dissociation (KD) à déterminer. Alors que cela place la spectroscopie RMN dans une position favorable pour déterminer les paramètres d’interaction pour de nombreuses interactions moléculaires biologiquement pertinentes, les ligands pharmacologiques ont souvent des valeurs KD dans la gamme nanomolaire. La spectroscopie de fluorescence avec sa sensibilité supérieure semble mieux adaptée pour caractériser de tels ligands, mais nécessite une fluorescence du ligand ou du récepteur pour changer lors de l’interaction. La faible solubilité dans l’eau est une autre question récurrente lors de la caractérisation des propriétés de liaison des ligands pharmacologiques, par laquelle l’ajout de solvant inorganique et leur effet sur la liaison protéique et protéique doivent être soigneusement contrôlés.Avec une série donnée de ligands (non) apparentés, recherche typiquement un classement relatif des molécules et potentiellement pour des informations sur l’identité du site de liaison. Les expériences de compétition sont le choix le plus évident pour un tel classement. Nous proposons ici l’utilisation de la spectroscopie RMN dans une expérience de compétition qui donne des valeurs de KD relatives simultanées pour les ligands et aussi des informations qualitatives sur le site de liaison. Nous démontrons la méthode en classant la liaison de la N-méthyl d-Ala3 / N-éthyl Val4 cyclosporine A (appelée Alisporivir) vers la cyclophiline A humaine (CypA) par rapport à sa molécule mère cyclosporine A (CsA) et deux intermédiaires chimiques , le N-éthyl Val4 Cs (EthV4Cs) et le N-méthyl Val4 Cs (MeV4Cs). L’alisporivir est un analogue non immunosuppresseur de CsA (figure S1 dans l’information de support) qui présente de meilleures propriétés antivirales que CsA inhibant la réplication de réplicons subgénomiques du VHC.1,2 Le classement des ligands de la liaison CypA pourrait aider à établir si l’affinité différentielle peut expliquer l’observation biologique de Le caractère antiviral supérieur d’Alisporivir.Lors de la complexation de la protéine avec l’un ou l’autre des ligands, nous avions précédemment noté3 que les changements de vitesses chimiques différentielles, c’est-à-dire entre CypA et CypA, étaient très limités et localisés, mais pouvaient clairement être observés pendant un certain temps. Quelques pics de résonance (figure 11 et figure S2 dans l’information de support) En outre, avec des valeurs de KD attendues dans la gamme nanomolaire, l’échange chimique des ligands devrait être lent sur l’échelle de temps RMN et donc permettre l’observation simultanée des résonances libres CypA, CypA &#x02212, CsA, et CypA − Alisporivir dans le spectre de cohérence quantique mononucléaire [HS, C] de 1H, 15N d’un mélange de différentes molécules.Figure 1 Partie supérieure: Détails de [1H − 15N] HSQC montrant la résonance du résidu Arg 55 des complexes CypA libre et CypA − CsA et CypA − Alisporivir Superposés sont les projections 1D. De gauche à droite, HSQC correspondant au temps points … A 1 : 1 CsA: Le mélange d’alisporivir provenant de solutions mères individuelles à 5 mg / ml dans du chloroforme des deux undécapeptides a été directement déposé dans un tube RMN standard. Le chloroforme a été évaporé sous flux d’azote, laissant une couche solide blanche contenant les deux ligands à l’interface du verre. Une solution de protéine CypA marquée au 15N a été introduite dans ce tube, et des spectres séquentiels [1H, 15N] -HSQC ont été enregistrés. Alors que les résonances correspondant à la protéine CypA libre étaient initialement les seules détectées, de nouvelles résonances qui avaient été assignées aux deux complexes CypA3 apparaissaient progressivement (Figure 1) .1). L’intégration de ces pics dans une série de spectres HSQC a montré une diminution linéaire des pics de CypA libres, reflétant le chargement complet de la protéine avec les ligands. Les intégrales de pic correspondant à CypA dans son complexe avec l’un ou l’autre ligand ont montré simultanément une première phase d’augmentation linéaire. L’augmentation identique des intégrales de pic de CsA et d’Alisporivir CypA pendant la phase dynamique de désorption du ligand atteste que les deux composés sont également disponibles pour la protéine. Lorsque nous avons séché un mélange avec un ratio 2: 1 d’Alisporivir et de CsA dans le tube de RMN, la pente d’augmentation des pics CsA et de CypA reflétait cette proportion (Figure S3 dans l’Information de Support), Après cette phase de désorption, lorsque les pics correspondant à la CypA libre avaient presque disparu, un nouvel équilibre avec la charge différentielle des deux ligands s’installe. Pour l’échantillon a commencé avec un rapport de 1: 1 de CsA et Alisporivir (Figure ​ (Figure1), 1), nous avons en effet trouvé une redistribution différentielle de la protéine Cyp entre CypA − Alisporivir et CypA − CsA. Le complexe CypA − Alisporivir représente 59 ± 2,4% de la protéine totale en moyenne par rapport à l’intégration de neuf résonances avec décalage chimique différentiel dans un spectre haute résolution à 900 MHz (Figure S2 dans l’Information de Support). La procédure a été répétée avec des résultats dans l’écart-type dans plusieurs expériences indépendantes (figure S4 dans les informations de support) région. Une expérience de contrôle HSQC effectuée après 2 et 7 jours a montré que ce rapport reste constant et correspond donc à une vraie valeur d’équilibre. Nous avons comparé de manière similaire le chargement de CypA avec un mélange 1: 1 d’Alisporivir: EthV4Cs mais trouvé dans ce cas que les complexes CypA − Alisporivir et CypA − EthV4Cs sont presque identiques une fois l’équilibre atteint (Figure 22 et Figures S4 et S5 dans les Informations de Support) (51 ± 2,9% de CypA − Alisporivir.) Des résultats similaires ont été obtenus avec Alisporivir et MeV4Cs (53 ± 2,7% de CypA & Al2 # 2212; Alisporivir) (Figure ​ (Figure22) .Figure 2Détails de [1H − 15N] HSQC montrant des résonances du résidu Phe67 de [15N] -CypA dans les complexes MeP4Cs de CypA et d’Alisporivir, de CypA et d’Ethv4Cs ou de CypA et superposés sont la projection 1D. ..Pour voir comment cela se traduit par des constantes d’affinité relative, nous pouvons écrire l’équili Les deux équations de CypA se liant à CsA et à Alisporivir: et en divisant les deux équations les unes par les autres, on obtient directement le dernier rapport [CypA − Alisporivir] / [CypA − CsA] # x02212; Alisporivir) / I (CypA ​​− CsA) comme déterminé ci-dessus. Le premier rapport [CsA] / [Alisporivir] reflète la concentration à l’équilibre des deux ligands et correspond à leur solubilité relative. Dans notre cas précis de CsA et de dérivés chimiques, la solubilité dans l’eau est un facteur limitant, et les conformations multiples d’au moins CsA4 excluent l’utilisation de spectres RMN 1D pour évaluer la solubilité relative des composés sur la base des seules intensités de pic.Par conséquent, 100 μ L d’une solution aqueuse saturée d’Alisporivir ou de dérivés chimiques ont été chargés sur une colonne en phase inverse pour évaluer leur solubilité relative. La surface du pic d’absorption à 215 nm contrôlant l’élution de la colonne reflète directement la solubilité dans l’eau et était identique pour tous les composés (figure S6 dans l’information de support), conduisant à une valeur de 1 pour le rapport des concentrations de ligand à l’équilibre. En conséquence, le rapport des constantes de dissociation KD (CypA) et KD (CypA) est donc directement reflété par le rapport des deux complexes CypA et CypA. pour le complexe CypA / CsA basé sur la spectroscopie de fluorescence par des changements de fluorescence intrinsèque Trp, 5 la résonance plasmonique de surface6 et la méthode basée sur la spectrométrie de masse7,8 ont été rapportées dans la littérature et varient généralement entre 10 et 200 nM. Nous devrions noter que la synthèse d’un analogue de CsA fluorescent a été nécessaire pour affiner la valeur basée sur la fluorescence Trp de 42 ± 50 à 11 ± 1 nM.5 En prenant cette dernière valeur de 11 nM pour les constantes de liaison KD CsA à CypA, 6 une valeur KD de 7 nM peut être calculée pour l’Alisporivir. Ceci est corrélé avec la meilleure activité anti-PPIase in vitro et l’activité anti-VHC de l’Alisporivir par rapport aux autres dérivés du Cs.1,2 MeV4Cs et EthV4Cs n’ont pas la fraction méthyle sur le C α du résidu 3 qui caractérise l’Alisporivir mais montre néanmoins pratiquement la même amélioration d’affinité que l’Alisporivir par rapport à la CsA. Bien qu’en accord avec les études fonctionnelles antérieures qui ont montré une valeur IC50 inférieure pour les deux composés par rapport à CsA, 7,8 cette conclusion est quelque peu inattendue puisque le résidu 4 dans le cycle Cs n’est pas directement lié par CypA (Figure S2 ). Nos résultats soulignent donc l’importance de cette modification chimique pour conférer une meilleure affinité à CypA par rapport à CsA.3 La méthode RMN décrite ici permet donc de déterminer l’affinité relative des ligands submicromolaires dans un mélange, même lorsqu’ils présentent une faible solubilité dans eau. L’absence de tout cosolvant et l’intégration d’étapes de contrôle telles que la pente initiale sont des avantages supplémentaires. Comme nous l’avons montré avec une série de ligands CsA, nous avons pu disséquer l’impact subtil de modifications chimiques discrètes sur l’affinité de liaison. Cela pourrait s’avérer très utile dans les étapes initiales d’amélioration d’une molécule active qui nécessitera souvent d’augmenter son affinité pour la protéine cible.