Infectiosité des patients atteints de leishmaniose cutanée post-kala-azar à sabler des mouches: réexamen d’une preuve de concept dans le contexte du programme d’élimination du kala-azar dans le sous-continent indien

Nous avons comparé le xénodiagnostic avec une réaction en chaîne par polymérase quantitative dans des biopsies cutanées de patients atteints de leishmaniose dermique maculopapulaire ou nodulaire post-kala-azar. PKDL Tous les patients infectés par le phlébotome Les charges parasitaires dans la peau variaient de parasites à microgrammes. programme d’élimination du kala-azar

la leishmaniose, la leishmaniose dermique post-kala-azar, le contrôle, le xénodiagnostic, le Bangladesh, l’Inde et le Népal ont lancé une initiative ambitieuse pour éliminer la leishmaniose viscérale VL ou kala-azar en tant que problème de santé publique. [Depuis lors, l’incidence estimée de la LV a diminué de% et l’incidence cible a été atteinte pendant des années consécutives dans tous les districts endémiques du Népal,% des sous-districts du Bangladesh et% des blocs en Inde. Cependant, l’initiative ne comportait aucune mesure pour traiter la leishmaniose dermique post-kala-azar PKDL, affection cutanée affectant habituellement les individus après un traitement au kala-azar Dans le sous-continent indien, on estime que % des patients atteints de kala-azar développent PKDL – années après traitement L’importance primordiale du PKDL provient de son rôle de réservoir d’infection Les patients atteints de PKDL ne sont pas systématiquement malades et peuvent ne pas être traités pendant des années Le traitement nécessite de longues périodes de stibogluconate de sodium SSG ou, plus récemment, miltefosine Bien que de nombreux chercheurs émettent l’hypothèse que le traitement par SSG augmente le risque, PKDL a eu lieu après l’amphotéricine liposomale, L’incidence de kala-azar proche de la cible d’élimination, il est de plus en plus urgent de mieux définir l’infectiosité du PKDL et de quantifier son rôle dans le maintien de la transmission de la kali-azar. La rareté des études est due à la difficulté de maintenir des colonies de phlébotomes stables et à l’impossibilité pratique d’effectuer un xénodiagnostic sur un grand nombre de patients. Idéalement, le xénodiagnostic pourrait être remplacé par un marqueur de substitution, par exemple, quantification moléculaire de parasites dans différentes formes de PKDL à différents stades de l’évolution Cette étude de preuve de concept incluait des patients atteints de PKDL et visait à fournir une comparaison préliminaire du xénodiagnostic direct. dans les biopsies cutanées et le sang périphérique

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Le protocole a été approuvé par le comité d’examen éthique du Centre international pour la recherche sur les maladies diarrhéiques, Bangladesh icddr, b nombre PR- Les patients ont fourni un consentement éclairé par écrit au Centre de recherche Surja Kanta Kala-azar SK KRC, Mymensingh Medical College, la surveillance des médecins Aucun événement indésirable survenu Les patients ont été référés pour traitement selon les protocoles nationaux

Procédures

Critères d’exclusion inclus toute autre maladie ou antécédent d’allergie aux piqûres d’insectes Les lésions ont été classées comme des macules, des papules ou des nodules, et la zone touchée a été identifiée comme étant une macule, une papule ou un nodule. Les sérums ont été testés par le test rapide de rK InBios, Seattle Washington et le test d’agglutination directe. Après l’antisepsie, une bécasse cutanée de × -mm a été recueillie par scalpel à partir d’un zone avec des lésions Une moitié a été utilisée pour les dosages moléculaires; l’autre a été utilisé pour préparer un frottis d’empreinte, coloré au Giemsa et examiné au microscope optique. Quantification suivie de pratiques de frottis cutanés d’impression de leishmaniose; correspondait à parasite dans les champs

Colonie de mouches des sables

Une colonie a été établie à SK KRC à partir de femelles de Phlebotomus argentipes nourries de sang sauvage. Vingt femelles de première et deuxième génération choisies au hasard ont été analysées par RT-PCR par PCR à transcription inverse pour exclure une infection par flavivirus et phlebovirus; tous étaient négatifs Les mouches du sable utilisées dans le xénodiagnostic appartenaient à ces générations

Xénodiagnostic

Chaque participant a placé sa main dans une cage contenant des phlébotomes âgés de – Figure E Les mouches ont également été nourries de lésions dans un tube de -cm de diamètre surmonté de gaze Les mouches engorgées ont été maintenues à ° C et% -% d’humidité. nourris exclusivement de% saccharose. La dissection a été planifiée pendant des heures après l’ingestion de sang. Les gencives ont été examinées individuellement par microscopie et, lorsqu’elles étaient négatives, ont été traitées par qPCR.

Figure View largeTélécharger slidePost-kala-azar patients atteints de leishmaniose cutanée inclus dans les expériences de xénodiagnostic A, Patient: flèches maculaires vertes et des flèches blanches nodulaires B, xénodiagnostic direct utilisant un petit tube C et D, patients: lésions nodulaires sur l’avant-bras et l’abdomen E, Xénodiagnostic direct en plaçant la main dans une cage avec des phlébotomes F et G, Patient: lésions maculaires étendues sur les avant-bras, l’abdomen et le dosFigure Vue largeTélécharger slidePost-kala-azar patients atteints de leishmaniose cutanée inclus dans les expériences de xénodiagnostic A Patient: flèches maculaires vertes et nodulaires blanches lésions des flèches B, xénodiagnostic direct avec un petit tube C et D, Patient: lésions nodulaires sur l’avant-bras et l’abdomen E, xénodiagnostic direct plaçant la main dans une cage avec des phlébotomes F et G, Patient: lésions maculaires étendues sur les avant-bras, l’abdomen et le dos

PCR quantitative

Les échantillons de mésogastre des tissus, de la couche leucocytaire et du mésogastre ont été traités à l’aide de kits Qiagen PCR en temps réel, amorces R / R Sigma-Aldrich pour l’ARN ribosomique des sous-unités et LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche Applied Science, Suisse ont été extrapolés dans une courbe standard pour estimer la charge parasitaire

RÉSULTATS

Les manifestations PKDL allaient de patients atteints de macules péribuccales bénignes à nodules localisés patients atteints de maladie maculopapulaire chronique étendue. Tableau et Figure Tous les patients présentaient une sérologie positive, une microscopie et une qPCR dans la peau, mais les échantillons leuco-plaquettaires étaient négatifs selon qPCR La proportion de mouches gorgées par expérience variait de% à% Patient était un fumeur avec des macules péribuccales limitées; La dissection de la mouche a été effectuée quelques heures après l’ingestion, des heures plus tôt que prévu, ce qui réduit la probabilité de détecter des promastigotes. Dans tous les cas, au moins une mouche du sable a développé une infection détectable chez les patients et les mouches gorgées dans les expériences en cage étaient positives par PCR

Tableau Caractéristiques du patient, paramètres de laboratoire et résultats du xénodiagnostic chez les patients atteints de leishmaniose cutanée post-kala-azar, Bangladesh Caractéristique ou conclusion Patient Patient Patient Sexe Homme Masculin Masculin Âge, y Profession Tailleur Entreprise Construction Histoire de la LV Non Oui Oui Traitement médicamenteux VL NA SSG SSG Temps écoulé depuis le traitement VL, mo NA Traitement PKDL précédent Oui Non Oui Traitement PKDL médicament AmBisome NA SSG Date du traitement PKDL Avril NA Juillet Durée des lésions actuelles, mo Type éruption Maculaire Mineure Non Vasculaire Papale Mineure Non Non Nodulaire Non Abondante Non Note d’étendue de l’éruption du titre DAT rK Positif Positif Positif Buffy coat qPCR Négatif Négatif Négatif Résultats de la biopsie cutanée Microscopie Positif Positif Positif Cycle thresholda Parasites par microgramme Xenodiagnosis results, no / No% Main dans la cage des mouches de sable Fed / exposé fli es / / / Microscopie positive / mouches disséquées / / / PCR positive / mouches traitées / / / Tube de phlébotomes appliqué sur la peau Fed / mouches exposées / / / Microscopie positive / mouches disséquées / / / PCR positive / mouches traitées Non effectué / / Positif par n’importe quelle méthode / / / Caractéristique ou Trouver Patient Patient Patient Sexe Homme Masculin Masculin Âge Âge, y Profession Tailleur Entreprise Construction Histoire de la LV Non Oui Oui VL traitement médicamenteux SS SSG SSG Temps depuis traitement VL, mo NA Traitement PKDL précédent Oui Non Oui PKDL traitement médicamenteux AmBisome NA SSG Date du traitement PKDL Avril NA Juillet Durée des lésions actuelles, mo Type éruption Maculaire Mineure Non Papuleuse étendue Mineure Non Non Nodulaire Non Abondante Non Score de l’étendue de l’éruption DAT titre rK Positif Positif Positif Buffy coat qPCR Négatif Négatif Négatif Résultats de la biopsie cutanée Microscop y Positif Positif Positive Cycle thresholda Parasites par microgrammes Xenodiagnosis results, no / No% Main dans la cage des phlébotomes Fed / mouches exposées / / / Microscopie positive / mouches disséquées / / / PCR positive / mouches traitées / / / Tube de phlébotomes appliqué à la peau Nourris / mouches exposées / / / Microscopie positive / mouches disséquées / / / PCR positive / mouches traitées Non fait / / Positif par n’importe quelle méthode / / / Abréviations: DAT, test d’agglutination directe; NA, non applicable; qPCR, réaction de polymérisation en chaîne quantitative; PKDL, leishmaniose dermique post-kala-azar; SSG, stibogluconate de sodium; VL, leishmaniasisa viscéraleMean de tests par qPCRView Large

DISCUSSION

Les chercheurs ont observé depuis longtemps des cycles épidémiques de LL qui durent environ plusieurs années et qui se répètent tous les ans; On suppose que ces modèles résultent de l’augmentation de l’immunité collective suivie d’une période de nadir où les nouveaux sujets sensibles rejoignent la population par la naissance et l’influx migratoire Le pic de l’incidence kala-azar peut être suivi d’un plus faible pic de PKDL [ Les recherches antérieures au Bengale occidental ont suggéré que les patients PKDL constituaient le réservoir interépidémique et introduisaient la transmission dans de nouvelles zones En supposant un accès au traitement, les cas de kala-azar peuvent être suivis à l’aide de données basées sur les installations, Pour quantifier la contribution de PKDL aux mesures de transmission et de contrôle modèle nécessaires pour consolider l’élimination, les données sur la distribution des cas dans la communauté, y compris les caractéristiques cliniques, la durée et le comportement de recherche de soins, doivent être combinées avec des données sur l’infectivité Cette étude représente un premier pas vers cet objectif. L’étude sur le xénodiagnostic a utilisé des mouches sauvages et une survie prolongée par voie alimentaire. g les avec du sang de souris après le repas de sang humain Bien que seulement des mouches ont montré des promastigotes après un seul repas, les proportions sont montées à et de mouches après et – repas de sang, respectivement L’étude, comme la nôtre, a utilisé mouches ; Les avantages comprennent la standardisation et la capacité de s’assurer que la colonie est exempte d’agents pathogènes. Cependant, les P. argentipes élevées en laboratoire ont une mortalité élevée quelques jours après l’ingestion de sang humain et leur survie ne peut pas être prolongée. , le taux d’alimentation était de%, et le pourcentage de mouches nourries est mort dans les heures suivant l’ingestion de sang, proportions semblables à celles de nos expériences. Par conséquent, nos résultats fournissent une estimation minimale de l’infectivité. Nous avons trouvé peu d’amastigotes par microscopie, même chez des patients présentant des charges parasitaires élevées par qPCR, mais tous les patients étaient infectieux contre les phlébotomes et avaient une qPCR positive dans la peau. Des études moléculaires antérieures ont démontré l’ADN parasitaire dans tous les types de lésions hypoglycémie. avec des charges parasitaires plus élevées dans la PKDL nodulaire que dans la PKDL maculopapulaire Comme dans nos données, les charges étaient les plus élevées dans les cas les plus anciens PKDL peut jouer un rôle important dû à la fois à une infectiosité élevée et à des périodes prolongées. Ces patients sont disponibles pour infecter les mouches. Les résultats de qPCR de la couche leucocytaire étaient négatifs, démontrant que les charges parasitaires cutanées sont cruciales. Les données de cette étude de preuve de concept sont limitées. susciter des doutes quant à la croyance classique selon laquelle les formes maculaire et papulaire sont significativement moins infectieuses que les PKDL nodulaires; Pour l’instant, nous devons supposer que tous les patients atteints de PKDL peuvent être infectieux. Des données provenant d’un nombre beaucoup plus grand de types de lésions, d’étendue et de chronicité sont nécessaires pour caractériser la distribution de l’infectivité et la transmission du modèle. de tous les patients PKDL dans le sous-continent indien , et soulèvent des questions sur la pratique de suspendre le traitement d’une PKDL légère au Soudan Un dépistage actif du PKDL sera nécessaire pour permettre une détection précoce et un traitement court, sûr et efficace facilitent grandement le traitement universel du PKDLXenodiagnostic est la norme d’infectivité mais la technique est complexe, nécessitant une expertise spécialisée et la génération d’un grand nombre de mouches, et présente des biais potentiels. Une colonie peut être un meilleur transmetteur qu’une autre. forcer les repas de sang et avoir une mortalité élevée après l’alimentation Certains patients sont plus attirants que d’autres; résidu de tabac, comme chez le patient, peut repousser les mouches Avoir plus de colonie par région contribuera à une connaissance plus robuste Trois groupes conduisent maintenant xénodiagnostic dans le sous-continent indien, avec des études prévues de & gt; Patients atteints de PKDL au cours des prochains mois La validation des mesures d’infectivité de substitution, telles que la qPCR, est également importante pour permettre le dépistage de nombreuses autres personnes que le xénodiagnostic et le dépistage d’autres infections potentielles telles que l’infection leishmanienne asymptomatique. sera crucial pour permettre une modélisation plus précise de la transmission et mieux prédire l’avenir du programme d’élimination

Remarques

Remerciements Nous remercions les Docteurs Maribel Jiménez et Vishal Goyal pour leur soutien technique, et le Mymensingh Medical College Hospital et le gouvernement du Bangladesh pour leur infrastructure et leur soutien cliniqueDisclaimer Les sources de financement n’ont joué aucun rôle dans la conception, la collecte, l’analyse et l’interprétation des les données, la préparation du manuscrit ou la décision de soumettre à la publication un soutien financier Ce travail a été soutenu par le Programme spécial de l’OMS pour la recherche et la formation concernant les maladies tropicales, en Suisse; Fondation espagnole pour la coopération internationale, la santé et les affaires sociales; et icddr, b principaux donateurs Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit d’intérêt signalé Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués