Inhibiteurs de la pyrazolopyridine de B-RafV600E. Partie 1: Le développement d’inhibiteurs sélectifs, biodisponibles par voie orale et efficaces

La voie de signalisation Ras / Raf / MEK / ERK (MAPK) transduit les signaux des récepteurs de surface cellulaire vers le noyau menant à la prolifération cellulaire, la différenciation et la survie. La famille Raf est constituée de sérine / thréonine kinases A-Raf, B-Raf et C-Raf (Raf-1), qui phosphorylent et activent la MEK, bien qu’avec des puissances biochimiques différentes (B-Raf > C-Raf ≫ A-Raf) .1 Des mutations dans le gène BRAF peuvent entraîner une amplification de la voie MAPK par l’activation constitutive de la B-Raf kinase et sont présentes dans environ 7% de tous les cancers.2 Le B-Raf mutant est le plus souvent associé au mélanome a été détectée dans jusqu’à 82% des mélanocytes cutanés, 3 66% des mélanomes primaires, 2 et 40% des mélanomes métastatiques.4,5 Autres cancers avec activation aberrante de B-Raf en raison de mutations oncogènes incluent papillaire cancer de la thyroïde (29 − 83%), 2,6,7 cancer colorectal (5 − 2 2%), 2 cholangiocarcinome (22%), 8 et le cancer de l’ovaire (30%) .2 Plus de 90% des mutations détectées dans B-Raf sont un acide glutamique pour la substitution valine au résidu 600 (V600E), 2 qui conduit à l’activité constitutive kinase 500 fois plus grande que B-RafWT et corrèle avec l’augmentation de la malignité et la diminution de la réponse à la chimiothérapie.9 − 12 Ainsi, les cancers induits par activation constitutive de la voie de signalisation MAPK découlant de B-RafV600E devraient L’invention concerne la découverte d’inhibiteurs sélectifs, biodisponibles par voie orale et efficaces de B-RafV600E qui utilisent un nouveau modèle de liaison charnière 3-méthoxy pyrazolopyridine. L’approche ciblée pour le développement d’une thérapie anticancéreuse a été validés par le nombre croissant d’inhibiteurs de la protéine kinase à petites molécules commercialisés14. Bien qu’il n’y ait pas d’inhibiteurs de kinases approuvés qui soient sélectifs pour B-RafV600E, quatre sont actuellement en essais cliniques, y compris RAF265 (Chiron / Novartis), 15 XL281 / BMS-908662 (Exelixis / BMS), 16 GSK2118436 (GlaxoSmithKline), 17 et PLX4032 (1, Plexxikon / Roche), 18 avec d’autres dans le développement préclinique.19 − compte tenu de la découverte et du développement clinique de 1, un inhibiteur sélectif de B-RafV600E qui se lie à la conformation active de la kinase (DFG-in), a récemment été publié.23 Les auteurs rapportent que le groupe propyle des effets sulfonamide B- RafV600E sélectivité en piégeant une petite poche lipophile élargie par un déplacement vers l’extérieur de l’hélice C &#2400 ;. Il a été en outre rapporté que le cycle difluorophényle de 1 occupe une poche hydrophobe adjacente au résidu du portier, Thr529. modélisation moléculaire, il a été supposé qu’un linker amide pourrait coupler un groupe aryle dans cette poche hydrophobe à un hétérocycle de liaison charnière, tout en formant une liaison hydrogène à l’hydroxyle de Thr529. Un couplage via une liaison amide permettrait également un criblage rapide et efficace de plusieurs groupes de liaison charnière potentiels.La série initiale d’inhibiteurs de B-RafV600E liés à un amide utilisait la pyridine comme accepteur de liaison hydrogène, qui était supposée se lier à la NH2 du résidu de charnière Cys532. Le schéma 1 illustre la synthèse de pyridine-amides 3 et les structures des deux partenaires de couplage d’acide benzoïque utilisés dans ce rapport (2a et 2b). 25Schéma 1 Préparation des amides de pyridine 3 et l’activité enzymatique de l’inhibiteur a été déterminée en utilisant -longueur B-RafV600E. L’inhibition de la phosphorylation ERK basale dans les cellules Malme-3M a été utilisée comme analyse cellulaire mécaniste et pour diriger les relations d’activité de la structure pour la série des amides.26 L’inhibition de la phosphorylation ERK a également été déterminée dans la lignée cellulaire A375 et, jusqu’à un ordre de grandeur moins sensible que la lignée cellulaire Malme-3M, a généré un SAR identique. L’activité micromolaire enzymatique et cellulaire de la pyridineamide 3 a révélé que des interactions supplémentaires seraient nécessaires pour atteindre une puissance utile (Tableau 1). La modélisation moléculaire a indiqué que l’addition d’un groupe 6-amino à la pyridine de 3 pourrait donner une liaison hydrogène au carbonyle de Cys532. L’amélioration de 4 fois de l’activité enzymatique et presque 3 fois l’amélioration de l’activité cellulaire de l’aminopyridine 4 a confirmé cette approche. L’addition de brome à la position 5 de 4 conduit au composé 5 et à une augmentation supplémentaire de 8 fois de l’activité enzymatique et cellulaire. Le modèle de liaison présumé, avec des liaisons hydrogène à Cys532 et Thr529, a été confirmé par une structure cristalline aux rayons X de l’amide 5 avec B-Raf (figure 1) (figure 1) .1). La structure cristalline a également révélé des contacts lipophiles clés formés par le groupe 5-bromo avec les chaînes latérales d’Ile463, Val471, Trp531 et Phe583, ce qui explique l’augmentation de la puissance sur 4. Cependant, malgré l’amélioration de 20 fois en activité de 3 à 5, l’activité cellulaire des amides de pyridine reste insuffisante pour une efficacité in vivo. La structure cristalline de la figure 1 est de 5 dans un complexe avec B-RafWT. La surface fendue est rendue en violet, les résidus sélectionnés sont représentés en blanc et l’inhibiteur est vert. Les interactions hydrogène-liaison sont illustrées avec des lignes pointillées jaunes. Plusieurs résidus … Tableau 1 Activités enzymatiques et cellulaires des inhibiteurs de la série des amides B-RafV600E Pour améliorer encore la puissance de la série des amides, des hétérocycles bicycliques ont été préparés en remplacement de la matrice de liaison à la pyridine. La cyclisation de l’amine donneuse charnière de 4 à la position 5 de la pyridine via un cycle à cinq chaînons suggère trois noyaux bicycliques potentiels: l’imidazopyridine, la pyrrolopyridine et la pyrazolopyridine. Ces bicyclettes ont été conçues pour former une interaction de liaison hydrogène bidentate au niveau de la charnière, améliorer l’interaction avec l’indole de Trp531 et fournir un point de diversité pour la synthèse analogique. Le schéma 2 illustre la synthèse des analogues de l’imidazopyridine et de la pyrrolopyridine-amide 8 − 10. Bien que l’imidazopyridine 8 ait eu une activité enzymatique encourageante, l’activité cellulaire était médiocre (tableau 1). Ce résultat était surprenant étant donné qu’un liant charnière imidazopyrimidine apparenté a démontré une excellente activité cellulaire dans une autre série d’inhibiteurs de B-Raf.22 Alors que la pyrrolopyridine 9 avait une activité enzymatique similaire à l’imidazopyridine 8, elle était 20 fois plus active dans le test cellulaire. En outre, la pyrrolopyridine 9 était significativement plus puissante que les aminopyridines 4 et 5, démontrant l’avantage d’un liant charnière bicyclique. La bromation en position 3 de la pyrrolopyridine 9 a donné le composé 10 et une amélioration de l’activité cellulaire de deux fois. Ce résultat indique que la puissance peut être augmentée par une substitution appropriée à la position 3 du modèle de liaison charnière bicyclique.Schéma 2 Préparation de l’imidazopyridine et pyrrolopyridine Amides 8 − 10Le modèle de liaison charnière pyrazolopyridine a été préparé simultanément et a fourni le plus les inhibiteurs puissants de B-RafV600E de la série des amides. Un avantage clé de ce modèle incluait la facilité avec laquelle des substituants d’électronique variable pouvaient être incorporés synthétiquement en position 3 du noyau (Schéma 3). La condensation de nitromalonaldéhyde27 avec des 5-aminopyrazoles 3-substitués 11a et 1222222 c a fourni des pyrazolopyridines 12a et 121212; La bromation de 12a a introduit un précurseur synthétique (12d) à partir duquel une 3-amino pyrazolopyridine (12e) a été obtenue. Une réduction nitro de 12a et 1222 suivie d’un couplage avec les acides benzoïques 2a ou 2b a fourni des amides. La préparation du substituant à la position 3 de la pyrazolopyridine a entraîné des améliorations de l’enzyme enzymatique. et l’activité cellulaire des inhibiteurs tout en modulant de manière significative leurs propriétés pharmacocinétiques et physicochimiques. La pyrazolopyridine non substituée 13 était similaire à la pyrrolopyridine correspondante 9 (tableau 1).La plupart des substitutions à la position 3 [Br- (14), Me- (15) et Me2N- (16)] ont produit des inhibiteurs dans une gamme étroite d’activité et sans amélioration significative de la puissance au-dessus de 13. Une exception à l’appartement Le DAS observé à la position 3 de la matrice de pyrazolopyridine a été obtenu par l’introduction d’un groupe méthoxy.28 Cela a conduit à la 3-méthoxy pyrazolopyridine 17, l’inhibiteur le plus puissant de la série des amides. Les composés avec des substitutions d’halogène sur le fragment benzamide ont également été examinés. Alors que la substitution du chloro par du fluor en position 6 du benzamide a entraîné une amélioration de l’activité enzymatique de trois fois au sein de deux paires de composés, il n’y avait aucun changement dans l’activité cellulaire (18 vs 13 et 19 vs 17). Les composés 17 et 19 ont tous les deux une puissance similaire à celle du PLX4032 dans la lignée cellulaire A375, mais ils sont trois fois plus puissants dans les cellules Malme-3M. La structure cristalline aux rayons X de 17 dans le complexe avec B-Raf a encore confirmé le modèle de liaison de la série des amides (figure ​ (figure 2) .2). Il est important de noter que l’interaction proposée entre le noyau de liaison charnière bicyclique et Trp531 a été validée: une interaction entre la partie pyrazole de la bicyclette et l’indole de la chaîne latérale de Trp531 a été révélée et contribue probablement à l’amélioration de la puissance les pyridine amides 3 − 5.22Figure 2 Structure cristalline à rayons X de 17 dans un complexe avec B-RafWT. La notation est comme décrit pour Figure ​ Figure1.1. En plus des interactions de liaison à l’hydrogène décrites dans la Figure 1,1, le sulfonamide NH de 17 est en contact étroit avec le principal … La nature de la matrice bicyclique et ses substituants ont été trouvés avoir des effets significatifs sur les propriétés pharmacocinétiques et physicochimiques des inhibiteurs de la série des amides (Tableau 2). Des pyrrolo- et pyrazolopyridine-amides ont été dosés par voie orale chez des souris à raison de 30 mg / kg sous la forme d’une solution dans 40% de PEG400 / 10% d’éthanol / 50% d’eau, tandis que des composés sélectionnés étaient également administrés par voie intraveineuse. Ces composés présentaient typiquement une biodisponibilité orale élevée (% F) et une exposition orale (AUC). La clairance totale (CL) et le volume de distribution (Vd) étaient faibles et, à l’exception de 10, corrélés avec la liaison aux protéines plasmatiques (PPB). La solubilité dans l’eau variait d’une série à l’autre et était corrélée avec le point de fusion (pf), qui variait généralement entre 173 et 261 ° C; ces données suggèrent que des effets subtils d’empilement cristallin existent dans cette série, qui pourraient être modulés en faisant varier les substituants autour de la molécule. Malheureusement, les composés ayant les solubilités aqueuses les plus élevées présentaient également les plus faibles expositions orales (13, 15 et 16). La substitution du chloro en position 6 du cycle benzamide a des effets prononcés sur les propriétés pharmacocinétiques et physicochimiques: solubilité aqueuse atténuée, PPB accrue, clairance IV plus faible et AUC orale significativement plus élevée (18 vs 13 et 19 vs 17). Dans l’ensemble, les composés 17 et 19 présentaient la meilleure puissance et l’exposition combinées de cette série, ce qui illustre l’avantage de la matrice se liant à la charnière 3-méthoxy pyrazolopyridine. Cependant, lorsque ces deux composés ont été dosés par voie orale chez des souris à 100 mg / kg en utilisant la même formulation en solution, le composé 17 présentait une augmentation proportionnelle de l’exposition, tandis que la biodisponibilité orale de 19 chutait à 1%. La faible solubilité aqueuse et le point de fusion élevé de ce composé ont probablement conduit à la cristallisation dans l’intestin empêchant l’absorption. Tableau 2 Pharmacocinétique des souris et propriétés physicochimiques des pyrrolo- et pyrazolopyridine AmidesDans un effort pour sauver les pauvres pharmacokinetics du composé 19 à des doses plus élevées et en raison de préoccupations avec une posologie quotidienne de fortes concentrations de PEG400 dans des études toxicologiques et xénogreffes précliniques potentielles, 17 et 19 ont été reformulées sous forme de dispersion amorphe-séchée à 25% (SDD) sur un polymère acétate-succinate d’hydroxypropylméthylcellulose (HPMCAS ).29 Études pharmacocinétiques de pontage chez des souris 17 dosés par voie orale à 2,5, 10, 40 et 80 mg / kg ont révélé une réponse linéaire à la dose, bien qu’avec des biodisponibilités orales inférieures à celles de la solution soluble à base de PEG400 (F = 19 − 25 vs 48 − ). Néanmoins, l’exposition a dépassé les niveaux prévus pour atteindre l’efficacité dans les modèles murins de cancer entraînés par B-RafV600E. Le composé 19 a également été dosé sous forme de formulation de SDD chez des souris à 10, 30, 60 et 100 mg / kg et a démontré une biodisponibilité orale décroissante avec une dose croissante (F = 53, 28, 19 et 13%). Bien qu’une dose-réponse linéaire n’ait pas été atteinte, cette formulation a apporté une amélioration significative de l’exposition à 100 mg / kg pour 19 (13 vs 1%), une biodisponibilité supérieure à 17 à 10 mg / kg (53 vs 25%) et également dépassée les niveaux projetés pour atteindre l’efficacité.Pour caractériser davantage la puissance in vitro et préparer des études de xénogreffes murines, l’inhibition de la viabilité cellulaire par le composé 17 a été mesurée contre un panel de 13 lignées de cellules cancéreuses du mélanome et 10 du colon dirigées par la mutation B-RafV600E, et les puissances comparées au PLX4032 ( 1). Dans le mélanome, 17 était 2 fois plus puissant que 1 sur 8 des 13 lignées cellulaires testées et équivalent dans les 5 autres, alors que dans le cancer du côlon, 17 était 2 fois plus puissant que 1 dans 9 des 10 lignées cellulaires examinées. Le composé 19 a été criblé contre quatre des lignées cellulaires du cancer du côlon et était également plus puissant que 1. Pour Colo205, dans lequel des études de xénogreffes de souris ont été effectuées, les valeurs EC50 pour 17 et 19 étaient 80 et 70 nM par rapport à 240 nM pour 1 L’activité de 17 et 19 a également été déterminée par rapport à un panel divers de kinases et a démontré des profils de sélectivité similaires avec une sélectivité de 100 fois pour les kinases 223/228 examinées. Les composés 17 et 19 ne présentaient aucune inhibition des enzymes du cytochrome P450 à 25 ° C, aucune inhibition du canal hERG à 100 ° C et étaient négatifs dans le test de Ames pour la génotoxicité. Sur la base de leur puissance in vitro et de leurs propriétés pharmacocinétiques favorables, les 3-méthoxy pyrazolopyridines 17 et 19 ont été sélectionnées pour des études d’inhibition de la croissance tumorale dans le modèle de xénogreffe de souris Colo205. Les SDD de 17 et 19 ont été administrés à des doses croissantes pendant 17 ou 20 jours chez des souris avec des xénogreffes de Colo205 établies (tableau 3). Une inhibition de la croissance tumorale a été observée pour les deux composés avec une régression tumorale maximale de 76% à 125 mg / kg pour 17 et 95% à 100 mg / kg pour 19. L’analyse des échantillons tumoraux a montré que l’efficacité in vivo nécessite une inhibition prolongée des taux de Étant donné que le composé 19 était également actif à 17 dans le test biochimique et dans plusieurs tests cellulaires, l’efficacité supérieure de 19 dans toute la gamme de doses de l’étude de xénogreffe était probablement due à son exposition plus élevée. Les faibles volumes de distribution pour les deux composés (tableau 2) n’ont pas diminué l’efficacité des composés. De façon significative, au cours de la période de dosage, aucune toxicité et aucune modification significative du poids corporel n’ont été observées à aucune dose pour 17 ou 19.Table 3Dose Ranging Études sur l’inhibition de la croissance tumorale chez les xénogreffes de souris Colo205 Résumé, sélectif, biodisponible oralement, et inhibiteurs efficaces de B-RafV600E ont été développés. Ces inhibiteurs étaient basés sur une nouvelle matrice de liaison de charnière de 3-méthoxy pyrazolopyridine, qui a évolué à travers la conception basée sur la structure à partir d’un simple plomb de pyridine (3). Alors que l’activité de 3 était micromolaire dans les tests enzymatiques et cellulaires, l’introduction d’un donneur de liaison hydrogène, l’utilisation d’une matrice de liaison charnière bicyclique et l’ajout de contacts lipophiles ont fourni de puissants inhibiteurs de pyrrolo- et pyrazolopyridine de B-RafV600E. L’optimisation à la position 3 a finalement conduit aux 3-méthoxy pyrazolopyridines 17 et 19, qui ont démontré une amélioration de 300 fois de la pyridine en plomb 3. Les composés 17 et 19 étaient très puissants contre un large panel de lignées cellulaires cancéreuses entraînées par B -RafV600E, particulièrement ceux dérivés du cancer du côlon, et a montré une activité antitumorale significative dans un modèle de cancer du colon in vivo conduit par B-RafV600E. Bien que 17 et 19 aient été bien tolérés chez la souris au cours des études de xénogreffe, les inhibiteurs de la RAF ont été signalés comme activant la voie MAPK dans les cellules B-RafWT.19,20,22,31 & 332 Cette activation paradoxale a été associée à une prolifération accrue Les inhibiteurs de la pyrazolopyridine Raf activent également la voie MAPK, et les résultats de ces études seront présentés ailleurs.