Inhibition de la synthèse d’ADN par un agent hybride platine-acide aminé conduisant à une destruction cellulaire importante dans le cancer du poumon non à petites cellules

Carcinomes pulmonaires, dont plus de 80% sont classifiés histologiquement cancers du poumon (NSCLC), continuent d’être la principale cause de mortalité par cancer dans le monde.1 NSCLC, une forme notoirement chimiorésistante de la maladie, a été identifié par l’OMS comme un cancer incurable métastatique (catégorie 3) dans lequel les chimiothérapies conventionnelles vont réduire les tumeurs et prolonger la survie dans une petite population de patients et pour une courte durée.2 Plus de une décennie après cette évaluation qui donne à réfléchir et malgré le développement de nouvelles thérapies moléculairement ciblées 1, le résultat clinique de la maladie reste faible. Les études cliniques et biologiques récentes indiquent que la surexpression des protéines de la machinerie de réparation de l’excision des nucléotides (NER) est responsable de la résistance aux tumeurs et de l’échec du platine. La chimiothérapie à base de TNS-5 reconnaît et élimine les adduits à l’ADN qui faussent sévèrement et déstabilisent thermodynamiquement l’ADN double brin, comme les réticulations formées par le cisplatine [cis-diamminedichloroplatinum (II)]. Pour créer un agent qui produit son effet cytotoxique au niveau de l’ADN par un mécanisme différent de celui des médicaments cliniques actuels à base de platine, nous avons conçu un pharmacophore hybride platine-acridine non-réticulé.9,10 Ici, nous avons utilisé le NSCLC lignées cellulaires de divers degrés de résistance au cisplatine en conjonction avec des tests de prolifération cellulaire et l’analyse du cycle cellulaire pour démontrer que l’agent prototypique, [PtCl (en) (LH)] (NO3) 2 [co mpound 1, graphique 1; en = éthane-1,2-diamine, LH = N- (2- (acridine-9-ylamino) éthyl) -N-méthylpropionimidamide, cation acridinium], 10 est un puissant inducteur de la destruction des cellules cancéreuses significativement supérieur au cisplatine.Chart 1Structures des composés étudiés Pour évaluer les chimiosensibilités relatives des cellules cancéreuses NSCLC au cisplatine et au composé 1, des dosages de prolifération cellulaire colorimétrique (MTS) ont été réalisés dans trois lignées cellulaires, NCI-H460, NCI-H522 et NCI-H1435. Il a été démontré que la résistance au cisplatine de ces lignées était corrélée aux niveaux de transcription des gènes de réparation de l’ADN et de résistance multiple, NCI-H1435 étant le plus important et NCI-H460, la lignée cellulaire la moins résistante.11 Les concentrations inhibitrices dans la gamme micromolaire d’après les courbes de réponse au médicament pendant 72 h d’incubation du cisplatine avec les trois lignées cellulaires confirment cette tendance (tableau 1). En revanche, le composé 1 montre une augmentation spectaculaire de la cytotoxicité dans les trois lignées cellulaires. En NCI-H460, une IC50 de 8 ± 2 nM ont été déterminés, alors que dans NCI-H522, la CI50 était de 18 ± 2 nM, correspondant à une amélioration cytotoxique de 150 et 200 fois par rapport au cisplatine, respectivement (Tableau 1). Dans la lignée cellulaire la plus résistante, NCI-H1435, le composé 1 maintient l’activité micromolaire à une concentration inhibitrice environ 40 fois plus faible que celle observée pour le cisplatine (Tableau 1). Tableau 1 Récapitulatif des données de cytotoxicité (Valeurs IC50 ± SD, μ M) dans les lignées cellulaires NSCLCPour mieux comprendre la dynamique de la destruction des cellules cancéreuses produite par le composé 1 et le cisplatine, nous avons étudié l’interaction des deux complexes avec les cellules NCI-H460 en utilisant des mesures d’impédance. Dans ce test, un nombre fixe de cellules sont traitées avec un médicament dans des plaques de microtitration à 96 puits dans lesquelles chaque puits contient une microélectrode sensible aux changements dans l’indice cellulaire dus à l’adhérence / décollement cellulaire et aux changements de la morphologie cellulaire.12,13. le dosage fournit un moyen de surveiller en temps réel les effets des médicaments sur la croissance, la propagation et la prolifération cellulaires. Les cellules en croissance en phase logarithmique ont été traitées avec des concentrations variables de médicament platine, et les changements d’impédance ont été enregistrés pendant une période de 100 h. Les traces cinétiques enregistrées pour le composé 1 (figure 1A) montrent une diminution de l’indice cellulaire par rapport aux cellules non traitées, ce qui correspond à un effet cytotoxique dépendant de la concentration provoqué par l’agent hybride. À la concentration létale la plus élevée (IC90) et au cours de la période de traitement de 100 h, le composé 1 tue efficacement toute la population de cellules cancéreuses. Lorsque le cisplatine a été incubé avec des cellules NCI-H460 dans les mêmes conditions, mais à des concentrations spécifiques pertinentes pour l’inhibition de la croissance cellulaire effectuée par ce médicament, un résultat totalement différent a été observé (figure ​ (figure IB) .1B). Alors que le cisplatine entraîne une réduction globale de la prolifération cellulaire par rapport aux cellules non traitées, l’effet est significativement retardé et moins prononcé que dans le cas du composé 1, et un effet dépendant de la concentration n’est observé que pendant les 48 premières heures de traitement. Le plus frappant, alors que le cisplatine provoque initialement le retard le plus prononcé de la croissance cellulaire à la plus forte concentration (IC90) étudiée, le médicament ne parvient pas à réduire l’indice cellulaire terminal. Ceci met en contraste la situation du composé 1, qui provoque la destruction complète des cellules adhérentes à la concentration la plus élevée. Figure 1: Interaction du composé 1 (A) et du cisplatine (B) avec des cellules NCI-H460 contrôlées par détection électronique cellulaire en temps réel (RT-CES ). Pour le composé 1, IC25 = 4.4 nM, IC50 = 10 nM, IC75 = 35 nM et IC90 = 94 nM; Pour le cisplatine, IC50 = 1,6 μ M, IC75 = 4,7 … Dans des travaux antérieurs, nous avons démontré que les cellules cancéreuses traitées avec nos acridines de platine montrent les caractéristiques morphologiques et moléculaires de la mort cellulaire apoptotique.14,15 Parce que le composé 1 tue les cellules NSCLC significativement plus efficacement que le cisplatine, nous avons pensé que des différences pourraient exister entre les mécanismes préopoptotiques des deux composés. Pour répondre à cette question, les effets des deux agents sur la progression du cycle cellulaire ont été étudiés en utilisant la cytométrie de flux (Figure ​ (Figure2) .2). Les cellules NCI-H460 incubées avec un médicament à 90% de concentrations inhibitrices pendant 24 et 48 h ont été étudiées en même temps que des cellules non traitées. Le cisplatine a provoqué un ralentissement significatif de la progression des cellules viables à travers la phase S et une accumulation dans la phase G2 / M sur la base des pourcentages calculés de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire après 24 et 48 h d’exposition au médicament. (Figure 2C, D) .2C, D). Un ralentissement transitoire de la croissance cellulaire en phase S en réponse aux effets inhibiteurs du cisplatine sur la réplication de l’ADN et l’arrêt des cellules en phase G2 / M sont des perturbations communes du cycle cellulaire observées dans les cellules tumorales solides traitées au platine. En comparaison, les histogrammes générés pour le composé 1 montrent une accumulation de cellules à la frontière G1 / S et dans la phase S mais pas dans la phase G2 / M (Figure ​ Figure2E, F) .2E, F). De plus, des débris nucléaires provenant de cellules apoptotiques ou nécrotiques sont observés en tant que population sous-G1 pour des cellules traitées avec le composé 1, qui est pratiquement absent pour les cellules traitées au cisplatine (Figure 2C – F) .2C – F). Les perturbations du cycle cellulaire provoquées par le composé 1 se sont révélées dépendantes des concentrations d’incubation. Au point 24 h, par exemple, dans des incubations à IC70, le composé 1 provoque une légère augmentation des populations G0 / G1 et G2 / M de 8 et 2%, respectivement, et une diminution de la population S de 10%. L’inverse, et un effet plus prononcé, est observé à l’IC90, où une augmentation de la population cellulaire en phase S de 28% est observée par rapport aux cellules non traitées, rappelant un arrêt de phase S robuste à la concentration létale la plus élevée étudiée ( Informations complémentaires). Figure 2 Analyse du cycle cellulaire des cellules NCI-H460 non traitées (A et B) et des cellules traitées avec du cisplatine (C et D) ou du composé 1 (E et F) à des doses de IC90 pendant 24 et 48 h. Des histogrammes typiques sont montrés avec des distributions modélisées de cellules dans les phases G0 / G1 et G2 / M (rouge), … Des études antérieures ont suivi l’incorporation de 5-bromo-2 ′ -deoxyuridine (BrdU) pour démontrer que la phase S Pour confirmer que les effets du cycle cellulaire causés par le composé 1 sont également liés au blocage efficace de la réplication de l’ADN, la capacité à synthétiser l’ADN des cellules NCI-H460 traitées avec cet agent a été étudié en utilisant l’analyse cytométrique bivariée. Cette méthode détecte la distribution du cycle cellulaire basée sur la teneur en ADN total ainsi que les cellules synthétisant activement l’ADN. Ici, la dernière sous-population de cellules a été identifiée en utilisant le précurseur d’ADN modifié 5-éthynyl-2 ′ -désoxyuridine (EdU), qui peut être détecté avec des fluorophores modifiés par azoture en utilisant la chimie de conjugaison catalysée par cuivre (“ # x0201d;). 21 Pour évaluer l’impact du composé 1 sur l’activité de synthèse de l’ADN, les cellules NCI-H460 ont été incubées avec le médicament pendant 24 et 48 h et analysées ensuite pour la distribution cellulaire et la teneur en ADN. Les résultats de l’incorporation d’EdU dans l’ADN dans des cellules traitées au platine avec des expériences de contrôle sont montrés sur la figure ​ Dans chacune des analyses bivariées, la teneur en ADN global dans les cellules traitées et non traitées est mesurée par fluorescence d’iodure de propidium (PI) et portée en abscisse, et les niveaux de fluorescence résultant de l’incorporation d’EdU sont représentés en ordonnée. Les panneaux A et D de la figure ​ la figure 33 montrent la distribution du cycle cellulaire des cellules non traitées en l’absence d’EdU. En l’absence du composé 1, mais avec EdU présent dans le milieu de croissance, la fraction des cellules normalement proliférantes entrant dans la phase S (SE), les cellules dans la phase S et les cellules entrant dans G2 (G2E) sont identifiées par des niveaux de fluorescence élevés. incorporation de précurseur d’ADN cliquable par fluorophore (figure ​ (figure 3B, E) .3B, E). Pour les cellules incubées avec des concentrations létales (IC90) du composé 1 pendant 24 et 48 h, l’analyse cytométrique bivariée montre à la fois une perturbation caractéristique de la distribution cellulaire des cellules et une suppression prononcée de la réplication de l’ADN. incorporer le précurseur d’EdU dans l’ADN nouvellement synthétisé (figure ​ (figure 3C, F) .3C, F). Après 24 et 48 h d’incubation avec un médicament, les populations de cellules en prolifération sont de 25 et 6% de toutes les cellules viables, respectivement.Ceci correspond à une réduction des cellules synthétisant l’ADN par rapport aux témoins sans platine (Figure 3B, E) 3B, E) de 45 et 75%, respectivement. Plus important encore, les cellules restantes capables d’incorporer EdU (Figure 3C, F, 3C, F, intensités fluorescentes dans la boîte rouge) le font avec un ordre de grandeur efficacité réduite (noter que la fluorescence basée sur Edu est tracée Ces résultats sont en accord avec un arrêt de phase S robuste dans les cellules NCI-H460 causé par des concentrations létales du composé 1. Figure 3 Analyse du cycle cellulaire bivarié des cellules NCI-H460 incubées pendant 24 et 48 h (A et D). ) Cultures témoins non traitées (B et E) Cellules cultivées en présence de cellules EdU (C et F) incubées avec le composé 1 (IC90) et traitées avec EdU L’axe PE-PI-A … La présente étude démontre qu’un agent non réticulant à base de platine est capable de produire une amélioration cytotoxique prononcée par rapport au médicament clinique cisplatine dans des lignées cellulaires NSCLC de chimiorésistance à divers degrés, qui, pour la plupart, est médiée par une activité accrue de réparation de l’ADN. activité puissante observée pour le composé 1 m peut-être, en partie, du fait que les adduits à l’ADN formés par cet agent échappent au NER. Les protéines de reconnaissance des dommages à l’ADN (DDR) appartenant à la classe des protéines du groupe à mobilité élevée (HMG), qui reconnaissent le cisplatine, ne reconnaissent pas le produit d’addition monofonctionnel formé par le composé 1 (résultats non publiés). De même, ces adduits peuvent ne pas être détectés efficacement par les protéines DDR appartenant à la machinerie NER, une possibilité actuellement explorée dans notre laboratoire. Il convient de mentionner que le composé 1 maintient une activité supérieure à celle du cisplatine dans la gamme nanomolaire indépendamment du statut de l’oncogène KRAS et du statut du gène suppresseur de tumeur p53 dans NCI-H460 (KRAS muté / p53 sauvage) et NCI-H522 ( cellules KRAS / p53 mutées de type sauvage). Ceci est une découverte importante car ces mutations ont été corrélées avec la résistance et l’agressivité des tumeurs. 23,24 Sur la base des mesures d’impédance dépendant du temps, qui détectent les effets cumulatifs des changements dans le nombre de cellules, l’adhésion cellulaire et la morphologie cellulaire due aux médicaments. toxicité, le composé 1 tue les cellules NCI-H460 significativement plus efficacement que le cisplatine à des concentrations équitoxiques déterminées dans le test MTS. Le composé 1, mais pas le cisplatine, produit une diminution de l’impédance dépendante de la concentration, ce qui suggère que la viabilité cellulaire réduite déterminée dans le dosage colorimétrique se traduit par la mort cellulaire. En revanche, une augmentation de la dose de cisplatine ne tue pas les cellules dans une mesure qui serait attendue à partir des valeurs IC50 basées sur l’analyse MTS. Ces résultats suggèrent qu’il existe des différences critiques dans le taux et les mécanismes de destruction cellulaire causés par les deux agents. Des études antérieures ont montré que les médicaments au platine, généralement considérés comme induisant la mort cellulaire apoptotique, peuvent nécessiter des concentrations significativement plus élevées que les IC50 pour produire les caractéristiques morphologiques de l’apoptose.25 D’autre part, la signalisation préoptotique dans diverses lignées cellulaires cancéreuses, y compris NCI -H460, a été démontré être défectueux provoquant une destruction cellulaire inefficace par cisplatine.26,27 Ainsi, il semble que le composé 1 est un inducteur plus puissant de l’apoptose que le cisplatine. Les différences distinctes dans la destruction cellulaire observées pour les deux agents testés dans cette étude peut être finalement causé au niveau de l’ADN. Le cisplatine inhibe généralement la réplication de l’ADN de manière à ralentir la progression du cycle cellulaire à travers la phase S mais permet aux cellules de s’accumuler dans la phase G2 / M.16 Réparation efficace des réticulations et dérivation réplicative des adduits par les dommages inversement, le fait qu’aucune accumulation significative de cellules dans la phase G2 / M et une destruction cellulaire plus prononcée ne sont observés dans les cellules NCI-H460 traitées avec des composés de translesion tolérante tolérante 1 suggère que l’inhibition de la synthèse de l’ADN par les adduits de cet agent est plus létale pour les cellules que les effets des réticulations de type cisplatine. En conclusion, la présente étude révèle des différences mécanistes critiques entre la destruction cellulaire par le médicament anticancéreux classique cisplatine et le nouvel agent hybride de platine et d’acridine 1. Ces différences font du composé 1 un puissant agent antiprolifératif de loin supérieur aux thérapies cliniques actuelles à base de platine. Dans des travaux antérieurs29, nous avons démontré que le composé 1 produit des adduits d’ADN permanents beaucoup plus rapidement que le cisplatine (demi-vies de 20 min et 2 h, respectivement) qui, en plus d’une réparation inefficace par NER, peuvent contribuer à la capacité de l’agent hybride inhiber la réplication de l’ADN plus efficacement que le médicament clinique.Des agents ciblant l’ADN structurellement et mécaniquement uniques comme le composé 1 et ses dérivés, dont l’un a déjà démontré une activité dans un modèle de xénogreffe NCI-H460 très agressif10, peuvent conduire à des traitements pour des cancers chimiorésistants et devraient être poursuivis rigoureusement pour un développement préclinique ultérieur.