Les inhibiteurs HDAC à courte chaîne affectent différemment le développement des vertébrés et la chromatine neuronale

Actuellement, le développement est très optimiste d’inhibiteurs des histones désacétylases (HDAC) en tant que nouveaux agents thérapeutiques pour les troubles de la mémoire et de l’humeur. Une grande partie de cet intérêt provient d’études rapportant l’amélioration de la mémoire dans les modèles comportementaux des rongeurs par l’inhibiteur HDAC de l’acide carboxylique à chaîne courte butyrate de sodium.1 Le phénylbutyrate, un analogue du butyrate, un médicament approuvé par la FDA, inhibe les HDAC. Enfin, un autre acide carboxylique à chaîne courte, le valproate (VPA), développé à l’origine en tant qu’antipileptique 8, inhibe l’activité HDAC9,10 et est actuellement également en phase clinique. utiliser comme stabilisateur de l’humeur pour le traitement du trouble bipolaire11. Cependant, ces trois composés souffrent d’une faible puissance et, dans le cas du VPA, d’un index thérapeutique étroit.12 Dans une tentative d’amélioration de la puissance, ces inhibiteurs d’acide ont été convertis en analogues de l’acide hydroxamique. Nous avons estimé que la fraction acide carboxylique elle-même est critique pour l’inhibition des HDAC car l’analogue amide correspondant du VPA est inactif.13 L’acide hydroxamique est le fragment chélateur du zinc de l’acide suberoyl hydroxamique, SAHA (Vorinostat, Merck), un inhibiteur HDAC très puissant approuvé par la FDA pour le traitement des lymphomes cutanés à cellules T.14 D’autres inhibiteurs de l’HDAC à base d’acide hydroxamique sont actuellement en développement clinique, notamment Panobinostat (LBH-589, Novartis AG), Belinostat (PDX-10, TopoTarget), et IF2357 (Italfarmaco SpA). Trois acides hydroxamiques (2,154,16617) ont été préparés à partir des acides carboxyliques correspondants butyrate, phénylbutyrate et valproate (1, 3, 5) par estérification avec du méthanol, puis traitement des esters résultants avec de l’hydroxylamine dans du méthanol dans des conditions basiques (Schéma 1). .Scheme 1 D’après l’homologie structurelle, les isoformes d’HDAC dépendantes du zinc ont été divisées en trois classes: I (HDAC 1, 2, 3 et 8); IIa (4, 5, 7 et 9); IIb (6 et 10); et IV (11). Pour déterminer l’activité inhibitrice des HDAC des composés 1 et 6, nous avons utilisé un panel de tests couplés à la trypsine enzymatique in vitro avec des HDAC recombinants humains 1 − 9. Dans ces dosages, les isoformes de HDAC ont été incubées avec un substrat de tripeptide d’acétyl-lysine lié à un fluorophore de coumarine qui est conçu pour imiter l’acétyl-lysine 12 de l’histone H4. La désacétylation du substrat le rend sensible au clivage de la trypsine; ceci libère la fraction aminométhylcoumarine (AMC) qui a fortement augmenté la fluorescence sous la forme libre. L’utilisation d’un substrat de trifluoro-acétyl-lysine-AMC nouvellement développé pour les HDAC de classe IIa est essentielle à ces études, ce qui permet de mesurer l’activité enzymatique de ces HDAC sans contamination des HDAC de classe I qui ont déjà été confondues avec de nombreuses études. 18 Avec les concentrations de ces substrats fixées au Km pour chaque enzyme, les valeurs IC50 ont été déterminées pour chaque composé (Tableau 1). Tableau 1In Potentiel Vitro des Inhibiteurs HDAC de l’Acide Carboxylique et Hydroxamique Les données du Tableau I indiquent que les acides carboxyliques (1, 3 , 5) sont des inhibiteurs sélectifs des HDAC de classe I. Notamment, dans ces essais nouveaux et améliorés, nous avons constaté que la puissance des inhibiteurs était significativement plus élevée que celle indiquée dans les rapports précédents.13 En particulier, le butyrate (1) était le plus puissant des acides carboxyliques.Alors qu’un rapport précédent indiquait que la conversion de 1 en acide hydroxamique (2) augmentait sa puissance vers un mélange d’HDAC isolés du foie de rat, 23 nos données indiquent une activité accrue vers les enzymes de classe II, mais aucun effet sur l’inhibition des enzymes de classe I. L’analogue de l’acide hydroxamique du phénylbutyrate (4) a grandement amélioré la puissance vis-à-vis de toutes les enzymes. En revanche, l’acide hydroxamique de VPA (6, que nous appelons VAHA) a réduit la puissance vers HDAC de classe I, et a plutôt gagné en puissance vers les enzymes de classe II. Cette découverte est en accord avec un autre rapport récent décrivant les hydroxamates sélectifs de classe IIa.19 Nous avons ensuite testé la capacité des composés 1 et 6 à inhiber l’activité HDAC dans les cellules (Figure 1) .1). Nous avons utilisé des dosages par immunofluorescence pour étudier les effets de ces composés sur des substrats histones et non-histones dans des cellules HeLa humaines. Spécifiquement, nous avons mesuré l’acétylation des queues N-terminales des histones H3 et H2A: dans les deux cas, les effets composés étaient similaires (Figure 1; 1, données pour AcH3 non montrées), et reflétant les puissances in vitro. Pour les substrats non histones représentatifs, nous avons utilisé l’acétylation de la tubuline comme mesure de l’inhibition des isoformes HDAC de classe IIb, car la tubuline est désacétylée spécifiquement par HDAC6.20. Dans ces dosages, les acides hydroxamique 2 et 4 A contrario, VAHA (6) n’a eu aucun effet sur l’acétylation des histones, ce qui est en accord avec sa faible activité vis-à-vis des isoformes HDAC de classe I. Cependant, 2, 4 et, dans une moindre mesure, 6 ont induit une acétylation de la tubuline, compatible avec leur capacité à inhiber HDAC6 in vitro, alors que les acides carboxyliques 1, 3 et 5 n’ont eu aucun effet (Figure 2). Figure1b) .1b) Ainsi, ces données indiquent que l’hydroxa Les acides mic 2, 4 et 6 sont des inhibiteurs HDAC actifs cellulaires avec une puissance modifiée ou une sélectivité de cible HDAC qui est en corrélation avec leur activité in vitro.Figure 1Induction de l’acétylation des histones (a) ou tubuline acétylation (b) dans les cellules HeLa par acide carboxylique et inhibiteurs d’HDAC à base d’acide hydroxamique. L’histone H2A et l’acétylation de la tubuline ont été mesurées par immunofluorescence après 24 h de traitement … L’utilisation clinique du VPA (5) est tempérée par ses effets tératogènes 21, et la relation entre la spécificité isoforme des effets inhibiteurs HDAC du VPA et la tératogénicité reste à clarifier. Ainsi, nous avons testé les effets de VPA (5) et VAHA (6) dans un essai de développement d’un organisme entier à base d’embryon de grenouille (Figure ​ (Figure2) .2). Le VPA (5), à 2 mM, induit des anomalies de développement dramatiques chez les embryons de grenouille, y compris la perte des structures antérieures, le raccourcissement de l’axe postérieur antérieur, et des défauts cardiaques et pigmentaires, comme indiqué précédemment.21,22. à la même dose, VAHA (6) n’a pas induit ces défauts de développement. VAHA (6) a induit une acétylation de la tubuline, mais pas une acétylation des histones (Figure 2b), 2b), montrant qu’elle était active et sélective dans les embryons. Ces données supportent en outre la conclusion que la conversion de VPA (5) en VAHA (6) conduit à un nouvel inhibiteur sélectif de HDAC de classe II qui est actif dans les cellules. De plus, ces données suggèrent que l’inhibition des HDAC de classe I par le VPA (5) sous-tend sa tératogénicité.Figure 2Induction des défauts de développement chez les embryons de grenouille par VPA et VAHA, et effet de VAHA sur l’acétylation de la tubuline. (a) Essai de développement de Xenopus: à gauche, non traité; centre, VAHA (2 mM); à droite, 2 VPA (2 mM). (b) Induction de la tubuline ou de l’acétylation des histones .. rubéole. Enfin, nous avons testé les effets des composés 1 et 6 sur l’acétylation des histones et de la tubuline dans des cultures primaires de neurones du cerveau antérieur de souris (Figure 3) .3). Le cerveau antérieur contient plusieurs régions (cortex, hippocampe, striatum) connues pour jouer des rôles clés dans l’humeur et la mémoire24,25. À une concentration de 92,5 μ M, les dérivés d’acide hydroxamique 2 et 4 ont induit une forte acétylation des histones. les acides carboxyliques (1, 3, 5), ainsi que VAHA (6), étaient inactifs à cette concentration. En revanche, VAHA (6) était capable d’induire l’acétylation de la tubuline dans les neurones du cerveau antérieur, comme l’acide carboxylique 3. Figure 3 Induction de l’acétylation des histones (a) et de la tubuline acétylation (b) dans les cultures primaires de prosencéphale. L’acétylation de l’histone H3, de la lysine 9 ou de la tubuline a été mesurée par immunofluorescence après 24 h de traitements composés (composés 1 Ȣ 6, 92,5 mM). * … En conclusion, nous rapportons ici la synthèse et le test d’activité de nouveaux analogues hydroxamiques d’inhibiteurs d’HDAC d’acide carboxylique à chaîne courte. À ce jour, il a été démontré que les acides carboxyliques butyrate (1) et phénylbutyrate (3) améliorent la mémoire dans les modèles de comportement des rongeurs.1 − 5 Nous proposons que les analogues de l’acide hydroxamique du butyrate et du phénylbutyrate (2 et 4) pourraient présenter une activité encore plus grande dans ces modèles de mémoire, étant donné leur puissance in vitro et leur activité cellulaire améliorées (Tableau 1 et Figure 2). ).1). L’analogue de l’acide hydroxamique du valproate, VAHA (6), avait un profil d’activité in vitro et cellulaire cohérent avec celui-ci étant un inhibiteur sélectif de classe II. Il est intéressant de noter que des analogues analogues de l’acide hydroxamique du VPA se sont avérés facilement traverser la barrière hémato-encéphalique du sang 22 et qu’il a été démontré que le VAHA possède une activité anticonvulsivante in vivo.17 Comparaison des activités du VPA (5) et du VAHA (6) chez les rongeurs, les modèles comportementaux pourraient comprendre un test important du rôle des HDAC de classe I par rapport à la classe II dans la régulation de l’humeur et de la mémoire.