L’excrétion nasopharyngienne du coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère est associée à des polymorphismes génétiques

Contexte Un taux élevé de mortalité élevée associé à un coronavirus associé au SRAS associé à un coronavirus du SRAS dans les échantillons nasopharyngés était associé à un taux élevé de mortalité car tous les sujets infectés étaient dépourvus de l’immunité protectrice préexistante contre le SRAS-CoV. La base de données nationale sur le SRAS à Taïwan a été analysée, et le génotypage des SNP de polymorphismes mononucléotidiques des gènes a été effectué chez des patients atteints du SRAS, afin d’identifier les SNP dont la distribution entre patients avec ou sans excrétion nasopharyngée détectable Résumé: Le Titrage du CoV-SRAS excrété dans les échantillons nasopharyngés a varié considérablement, allant de non détectables à des copies d’ARN du SRAS-CoV / ml, et ils ont été corrélés positivement avec un taux de mortalité élevé P & lt; , par test de tendance et avec mort prématurée ie décès survenant dans les semaines suivant le début de la maladie P =, par test de tendance L’excrétion virale était plus élevée chez les patients masculins P =, par régression logistique multivariée et chez les patients plus âgés P =, par régression logistique multivariée Une excrétion naso-pharyngée détectable du SRAS-CoV était associée à des allèles polymorphes des interleukines P = et AP = et à un membre de l’homologue de l’oncogène viral réticulé endothéliose B [RelB] P =, tous de nature pro-inflammatoire, ainsi que la molécule de procoagulation protéine fibrinogène P = Conclusion La charge SARS-CoV est un déterminant des résultats cliniques du SRAS, et elle est associée à des polymorphismes de gènes impliqués dans l’immunité innée, qui pourraient être régulés en fonction de l’âge et du sexe. Les résultats de la présente étude ont conduit à des gènes impliqués dans la réponse de l’hôte à l’infection par le SRAS-CoV; si elles sont corroborées par des études fonctionnelles, ces résultats peuvent être applicables à d’autres virus respiratoires nouvellement apparus, par exemple, la souche pandémique de la grippe

Syndrome respiratoire aigu sévère Le SRAS est une maladie infectieuse récemment identifiée causée par un nouveau coronavirus, le SRAS-CoV, qui cause une mortalité importante, en particulier chez les patients âgés et les patients présentant des facteurs de comorbidité L’évolution clinique du SRAS suivi par le développement de symptômes respiratoires pouvant évoluer vers un syndrome de détresse respiratoire aiguë chez certains patients mais peut être assez spontanément résoluble chez d’autres. Les radiographies thoraciques en série de patients atteints du SRAS ont révélé des schémas distincts de progression de la maladie . récupération en corrélation avec la sévérité clinique de la maladie Ces résultats, en conjonction avec ceux des études cliniques des cytokines pendant la phase aiguë du SRAS , ont suggéré que le développement du syndrome de détresse respiratoire aiguë chez les patients atteints du SRAS est dû à réponse immunopathologique liée à une forte activation de l’immunité à médiation cellulaire de type T Cependant, une forte charge virale nasopharyngée initiale ou de pointe est associée à un taux élevé de mortalité , et une forte charge virale sérique est en corrélation avec un risque accru d’hospitalisation en soins intensifs. Un taux élevé de titres de SRAS-CoV a également été retrouvé à partir d’échantillons de salive et de prélèvements buccaux, ce qui soulève la possibilité que le virus se reproduise également dans les voies respiratoires supérieures Conclusions de l’autopsie pour les patients Le SRAS qui est mort quelques semaines après le début de la maladie a montré que la présence du SARS-CoV était répandue dans un certain nombre de tissus et d’organes et que, chez certains patients survivants, le virus demeurait pendant plusieurs jours [, La détection du virus dans les aspirats des voies respiratoires, les échantillons de sérum ou les spécimens fécaux au-delà du jour de la maladie suggérait une réplication virale continue et non altérée et indiquait un mauvais pronostic. l étude d’une série de tissus pulmonaires post-mortem, la détection d’une charge virale élevée dans le tissu pulmonaire était associée à un temps de survie de & lt; En raison de l’hypothèse selon laquelle tous les patients n’avaient pas d’immunité protectrice préexistante contre le SRAS-CoV ni d’accès aux antiviraux, ce qui peut modifier le taux d’excrétion virale, la base biologique des différences de charge virale chez les patients intrigants Dans ce rapport, la charge virale des patients ayant une infection confirmée par le SARS-CoV au moment de l’admission à l’hôpital a été analysée en fonction du sexe, de l’âge et du polymorphisme génétique des gènes impliqués dans la réponse inflammatoire et innée.

Matériel et méthodes

La base de données nationale sur le SRAS à Taïwan comprend tous les cas de SRAS confirmés en laboratoire entre mars et juin. Les détails de la compilation des données ont été décrits ailleurs Notre analyse portait sur la charge naso-pharyngienne initiale du SRAS au moment de l’admission. l’hôpital et inclus les patients dont les charges virales ont été quantifiées en utilisant un test de RT-PCR disponible dans le commerce Artus Real Art HPA-Coronavirus; Artus, ainsi que les patients qui ont eu des résultats négatifs successifs de tests d’échantillons nasopharyngés et pour lesquels les diagnostics de SRAS étaient basés sur une découverte positive de séroconversion d’anticorps neutralisant le SRAS L’étude génétique a été conçue pour comparer le contexte génétique des patients Tous les patients survivants atteints du SRAS ont été suivis, et des patients sans lien génétique avec un SRAS confirmé en laboratoire ont accepté de participer à cette étude. Un groupe de référence de sujets taïwanais a été sélectionné, sur la base d’un âge-SRAS avec ou sans SARS-CoV détectable. et un échantillonnage aléatoire stratifié selon le sexe, à partir d’une biobanque compilée dans le cadre d’une étude nationale sur la population des descendants chinois Han résidant à Taïwan Le protocole d’étude, y compris un consentement éclairé conforme à la cinquième édition de la Déclaration d’Helsinki, approuvé par le Comité d’éthique de la recherche médicale de l’Institut des sciences biomédicales de Taipei , Taiwan application # AS-IBMS-MREC – Sélection de SNP de polymorphismes de gènes et de nucléotides Nous nous sommes concentrés sur des gènes dont les produits sont connus pour interagir avec le SRAS-CoV dans des réponses antivirales, inflammatoires ou immunostimulantes Les SNP de ces gènes ont été identifiés dans des bases de données: le SNP Consortium, le National Center for Biotechnology Information, GeneSNPs Public Internet Resource, GeneCards et la base de données SNP au Japon. <% en fonction des résultats d'un test d'ADN sélectionné à partir de la puissance de population Han de référence, & gt;%

Le génotypage a été réalisé en utilisant soit le système Sequenom MassArray MALDI-TOF de Sequenom au centre national de génotypage de Taiwan, en utilisant des amorces pour le typage SNP qui ont été conçues en utilisant le logiciel Spectro-Designer Sequenom, ou le système ABI Applied Biosystems, si le système Sequenom n’a pas pu concevoir les amorces Pour le contrôle de la qualité, le génotypage de jusqu’à% des échantillons a été répété; Analyse statistique L’analyse des données a été effectuée, sauf indication contraire, en utilisant SAS, la version ou l’équilibre SAS / Genetics SAS Institute Hardy-Weinberg a été testé pour chaque résultat SNP. Le test de génotypage a été répété ou une autre méthode a été utilisée pour tester si les résultats violaient l’équilibre de Hardy-Weinberg Des haplotypes pour tous les SNP de chaque gène ont été prédits en utilisant le programme Phase Pour chaque SNP, une analyse univariée a été effectuée en comparant les fréquences des allèles et des génotypes entre patients avec ou sans CoS-CoV détectable dans les échantillons rhinopharyngés Des tests de modèles dominants / récessifs ou codominants ont été réalisés pour identifier les génotypes sensibles du SNP La valeur P empirique a été calculée en utilisant le test de permutation de, tours pour chaque SNP pour lequel une association avec la charge virale a été démontrée Tests d’importance qui ont été Le test de Cochran-Armitage, le test de Fisher et le test de Mantel-Haenszel ont été comparés. Les variables continues (âge et charge virale) ont été comparées à l’aide du test de Wilcoxon, pour analyser les facteurs qui auraient pu affecter la charge virale, y compris les caractéristiques démographiques, la source de l’infection et la durée de la maladie Les associations entre l’excrétion naso-pharyngienne du SRAS-CoV et plusieurs variables ont été analysées simultanément dans un modèle logistique cumulatif Les interactions entre gènes ont été testées dans un modèle logistique cumulatif.

Résultats

Charge nasopharyngée du virus du SRAS La charge virale dans les voies respiratoires au moment de l’admission à l’hôpital ou le diagnostic du SRAS variait de non détectable au SRAS-CoV. Nombre d’ARN / mL Figure Bien qu’une étude longitudinale des patients atteints du SRAS indique que le virus nasopharyngé la charge augmentait entre le cinquième et le cinquième jour de maladie et diminuait le jour de la maladie , les charges virales au moment de l’admission de tous les patients atteints du SRAS ne reflétaient pas cette tendance à la hausse et à la baisse Au cours des premières semaines de l’évolution clinique du SRAS Au cours de la première semaine de l’évolution clinique du SRAS, la charge virale nasopharyngée a varié largement chez les différents patients. Globalement,% des patients atteints du SRAS présentaient un taux indétectable de virus nasopharyngé excrétion, et ce manque de détection du virus n’a pas été corrélé avec le moment de la collecte des échantillons, parce que des échantillons successifs ont été obtenus à partir de ces patients, et le résultat du test s pour ces spécimens sont restés négatifs

Figure Vue détailléeDispositif de titrage du coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère SARS-CoV dans les échantillons nasopharyngés des patients par rapport au jour de la collecte des échantillonsFigure Vue largeToile de téléchargementCartographie des titres du coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère SARS-CoV dans les échantillons nasopharyngés de Facteurs influant sur le taux d’excrétion du virus Chez les patients atteints du SRAS, des taux indétectables d’excrétion naso-pharyngée du SRAS-CoV ont été observés plus souvent chez les patientes% que chez les hommes%, et plus fréquemment chez les patients plus jeunes % des patients & lt; chez les patients plus âgés% des patients ⩾ ans tableau et chiffre Lorsque seul le titre viral des patients présentant une excrétion virale détectable a été au centre de l’étude, les patientes ont systématiquement perdu plus de titres de virus que les hommes. le modèle de régression logistique multivariée En outre, dans un modèle de régression logistique multivariée cumulative dans lequel la date de prélèvement des échantillons était contrôlée, et toutes les maladies sous-jacentes et la source d’infection identifiable ou non étaient considérées simultanément, le sexe féminin P = et l’âge La présence d’une maladie sous-jacente ou d’une source connue d’infection n’a pas influencé l’excrétion virale. L’absence de détection virale peut être le résultat de niveaux plus faibles d’excrétion virale survenant au moment du prélèvement de l’échantillon au début de la & lt; jours de maladie ou plus tard & gt; le modèle multivarié a confirmé que les prélèvements nasopharyngés dans lesquels les taux d’excrétion virale étaient indétectables étaient collectés en même temps que l’apparition de la maladie que les spécimens dans lesquels les taux viraux étaient détectables; l’absence de détection du virus ne correspondait pas à la collecte précoce des échantillons

Tableau View largeDownload slideDistribution des patients atteints de syndrome respiratoire aigu sévère SRAS, selon le coronavirus naso-nasal associé au SRAS coronavirus SARS-CoV charge au moment de l’admission, par caractéristiques démographiques et cliniquesTable Voir grandDownload slideDistribution des patients atteints de syndrome respiratoire aigu sévère SRAS, selon coronavirus associé au SRAS du nasopharynx associé au SRAS-CoV au moment de l’admission, selon les caractéristiques démographiques et cliniques

Figure Vue largeDownload slideRate de détection de l’excrétion du coronavirus associé au syndrome respiratoire aigu sévère SARS-CoV dans les échantillons rhinopharyngés des patients, tel que déterminé par RT-PCR, selon le sexe et l’âgeFigure Vue détailléeDownload slide of détection de l’excrétion du syndrome respiratoire aigu sévère- Signification du coronavirus SARS-CoV dans les échantillons rhinopharyngés des patients, tel que déterminé par RT-PCR, selon le sexe et l’âge Importance clinique de l’excrétion du virus Nous avons analysé le taux de mortalité par rapport aux taux d’excrétion virale pour valider la Tableau des prélèvements nasopharyngés Le taux de mortalité était de% chez les patients avec & gt; Copies d’ARN du SRAS-CoV / mL détectées dans les échantillons rhinopharyngés, alors que le taux de mortalité n’était que de% chez les patients présentant des taux indétectables de virus dans les échantillons rhinopharyngés De plus, la durée de survie des patients dont le SRAS était mortel était significativement raccourcie à & lt; semaines, avec des niveaux croissants d’excrétion de virus survenant au cours de la phase aiguë de la table des maladies chez les patients ayant des cas mortels de SRAS qui ont eu & gt; Des copies d’ARN du SRAS-CoV / mL détectées dans les échantillons rhinopharyngés,% sont mortes dans les premières semaines de SRAS, alors que parmi les patients avec des cas mortels de SRAS qui n’ont pas détecté de virus dans les échantillons nasopharyngés, seulement% sont morts dans les premières semaines de maladie P =, par test de tendance de Cochran-Armitage

Tableau View largeTélécharger Diapo-encéphalopathie aiguë sévère du nasopharynx Récepteur du SRAS coronavirus Charge du CoV-SRAS et durée de survie chez les patients atteints de SARSTable View largeTélécharger DiapositiveNasopharyngée Syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus associé au SRAS Charge du CoV-SRAS et durée de survie chez les patients Nous avons ensuite comparé la distribution génotypique des SNP entre les groupes de patients avec un tableau détectable ou indétectable d’excrétion virale et la figure. Nous avons ensuite comparé la distribution génotypique des SNPs associés à la détection du SRAS-CoV dans les échantillons rhinopharyngés Avec des données de mortalité validant la signification biologique de l’excrétion virale nasopharyngée indétectable des SNP testés, les SNP des gènes ont montré une association significative avec la charge virale IL-IL de -T rs dans le promoteur, IL-A ILA de -T rs en amont de l’ATG, RelB reticuloendothéliose homologue de l’oncogène viral B dans l’intron à T rs de l’ATG et de la protéine FGL de type fibrinogène La substitution des acides aminés de la glycine à l’acide glutamique a été surreprésentée chez les patients ayant des niveaux détectables de SRAS-CoV. Pour la distribution génotypique de chaque SNP, les valeurs P empiriques ont été calculées en utilisant des tests de permutation et ont confirmé la signification statistique de P & lt; table

Tableau View largeTéléchargement de diapositivesGymetricsGenetic et les charges de virus nasopharyngées des patients atteints de syndrome respiratoire aigu sévère SARSTable View largeTélécharger slideGymetricsGenetic et les charges de virus nasopharyngé des patients atteints de syndrome respiratoire aigu sévère SRAS

Vue de la figure grandDownload slidePower tracé contre la fréquence allélique de chaque polymorphisme mononucléotidique Puissance est calculée sur la base des fréquences alléliques et la taille de l’échantillon de patients atteints de syndrome respiratoire aigu sévère SRAS avec aucun patient, ou sans patients témoins, virus détectable Les lignes courbes désignent les zones de différences entre les fréquences alléliques des patients et des patients témoins. Chaque point noir indique un polymorphisme mononucléotidique tracé en fonction de la fréquence allélique des patients témoins atteints de SRAS sans coronavirus associé au SRAS visible. slidePower tracée en fonction de la fréquence allélique de chaque polymorphisme mononucléotidique La puissance est calculée sur la base des fréquences alléliques et de la taille de l’échantillon de patients atteints du syndrome respiratoire aigu sévère SRAS sans aucun cas, ou sans patients témoins, excrétion virale détectable. les lignes indiquent les zones o f différences entre les fréquences alléliques des patients et des patients témoins Chaque point noir indique un polymorphisme mononucléotidique tracé en fonction de la fréquence allélique des patients témoins atteints du SRAS sans coronavirus associé au SRAS détectable. L’analyse effectuée par stratification supplémentaire de ces gènes n’a pas suggèrent que toutes les interactions entre ces gènes ont contribué au niveau d’excrétion virale. L’analyse multivariée a confirmé que tous les loci étaient indépendamment associés au tableau de charge virale. En outre, les individus homozygotes possédant des allèles de -T IL présentaient un risque accru d’excrétion virale. ne possédant que l’allèle lorsque les génotypes des autres allèles ont été contrôlés Un total de SNP dans les gènes ont été typés, et des polymorphismes ont été trouvés sur des locus IL – et -, des loci RelB, au locus ILA, et au niveau des loci FGL -, – , et les haplotypes ont été analysés pour IL et FLG; un seul locus de IL – et FGL a montré une association avec la charge virale Nous avons comparé les distributions alléliques et génotypiques de ces loci entre les patients atteints de SRAS et les Taïwanais en bonne santé dans le groupe de référence, et nous n’avons trouvé aucune table statistique

Discussion

une système ; Les mutants RelB présentent une inflammation multiorganique sévère et fatale L’induction de NFκB, dont RelB est une sous-unité, est réduite dans les lymphocytes T des souris âgées et est un mécanisme potentiel pour expliquer la sénescence de l’immunité Que la variante génétique de RelB, qui est associée à une charge virale plus élevée, représente une fonction supprimée ou trop réactive de RelB ie, la signalisation de l’inflammation reste elusiveIL, qui est un membre de la famille IL et est également une cytokine pro-inflammatoire pléotropique dans l’activation des cellules tueuses naturelles et l’amélioration du T réponse immunitaire cellulaire de type, est exprimée de manière constitutive dans les poumons Il a été démontré que les souris knockout IL allaient éliminer plus efficacement le virus de la grippe et les allèles polymorphes de l’ILA prédisaient le contrôle de la virémie plasmatique chez les patients infectés par le VIH. sont sous traitement antirétroviral , ce qui suggère que l’IL et l’ILA participent toutes deux à l’élimination de l’infection virale au sens large. montré que la régulation de l’expression IL pourrait être dépendante du sexe Les résultats de l’infection ou le niveau de réponse à la vaccination a été noté pour démontrer les différences entre les sexes voir Beagley et al et Morales- Montor et al pour les commentaires; l’immunité innée et adaptative peut être régulée par les hormones sexuelles Un taux de mortalité plus élevé chez les hommes atteints du SRAS a été suggéré dans une analyse des bases de données de Hong Kong et de Taïwan ; il serait plus instructif si l’analyse avait inclus des informations sur le fardeau du rhinopharynx, qui est actuellement une méthode couramment utilisée pour diagnostiquer le SRAS et d’autres infections viralesFGL, une protéine inductible à l’IFN-y exprimée par les lymphocytes, macrophages et endothélium, est une prothrombinase qui a été rapporté pour contribuer au dépôt de fibrine pendant l’hépatite virale, et son expression est associée à un certain nombre de conditions pathologiques L’inclusion de FGL dans la présente étude était basée sur des rapports que l’expression de FGL pourrait être induite par la protéine nucléocapside de virus de l’hépatite virulente de la souris, également un coronavirus Le SNG FGL à montre également une association avec la sévérité clinique de SARS WY Tsai, CSJF, W-JC, VO, C-CK, Y-MAC, YT Lu, CL Liu, CL Chao, H-LC, H-WK, BL Chiang, FL, IJ Su, et M-SH, des données non publiées, et la protéine FGL est fortement exprimée dans les voies respiratoires, selon les résultats de l’analyse immunohistochimique ML Huang, LY Chao, et M -SH, données non publiées L’ARNm humain FGL s’est montré préférentiellement exprimé dans la mémoire lymphocytes T CD / CDR dans une étude Les patients atteints du SRAS qui étaient en âge avancé présentaient un taux de mortalité plus élevé et des charges virales plus élevées que les patients plus jeunes dans cette étude; comment ces observations sont liées à l’expression préférentielle de FGL dans la mémoire lymphocytes T reste à étudierLa plupart des patients avec le plus haut niveau de virus excrétant & gt; Les copies d’ARN du SRAS-CoV / mL n’ont pas été incluses dans notre analyse génétique en raison de leur mort prématurée. Par conséquent, il n’a pas été possible d’effectuer une analyse multivariée pour examiner simultanément les effets de l’âge, du sexe et du polymorphisme génétique sur la mort. l’augmentation de la charge virale chez les patients âgés reste insaisissable, que ce soit la sénescence de l’immunité voir Stout et Suttles pour une revue, qui sape l’efficacité de l’immunité innée et adaptative, ou l’infection virale renforcée, dont l’âge est un facteur de confusion Parce que les descendants Han, qui constituent>% de la population de Taiwan, sont génétiquement homogènes, selon une étude récente des SNP des complexes majeurs d’histocompatibilité , la stratification des populations qui confond nos résultats n’est pas un souci majeur. Le travail constitue une étude basée sur la population en ce sens que tous les patients survivants du SRAS ont été sollicités, et aucun biais de sélection n’a été impliqué dans la classification des patients participants. En conclusion, la charge du SRAS-CoV pendant la phase initiale de l’infection, qui est cruciale pour l’issue clinique des patients atteints du SRAS, est démontrée, pour quelle raison? Nous croyons que c’est la première fois, être associés à des polymorphismes de gènes impliqués dans l’immunité innée. Ces gènes, bien que n’étant pas une liste exhaustive, ont illustré les voies potentielles de l’immunité innée en réponse au SARS-CoV ou plus généralement infections virales Il est impératif de procéder à des études fonctionnelles pour tester si ces gènes sont effectivement fonctionnels dans les voies de signalisation à la suppression directe de la réplication du virus ou à la clairance des cellules infectées par le virus. ; semaines de maladie et la dernière étape & gt; semaines de maladie de la réponse de l’hôte pourraient contribuer à l’issue clinique du SRAS devrait être utile dans la gestion clinique des patients atteints du SRAS

Remerciements

Nous remercions toutes les infirmières en santé publique qui ont aidé à recueillir des données épidémiologiques; le personnel de la Division de la surveillance du Centre de contrôle des maladies de Taiwan qui a compilé la base de données épidémiologiques; et Yu-Jen Liang, qui a aidé à l’analyse des données. Soutien financier Academia Sinica et Taiwan National Science Conseil institutionnel # NSC – B — YPotentiel conflits d’intérêts MSH sert, au nom du Fonds de développement du Yuan exécutif de Taiwan Central Gouvernement, en tant que membre du conseil d’ADImmune Tous les autres auteurs: pas de conflits