Un essai clinique prospectif d’un essai de réaction en chaîne de la polymérase en temps réel pour le diagnostic de la candidémie chez les adultes non neutropéniques et gravement malades

Contexte L’infection invasive à Candida chez les adultes gravement malades non neutropéniques est un problème clinique qui a fait l’objet d’une attention croissante ces dernières années. La médiocre performance des modalités diagnostiques existantes a favorisé la prescription préventive fondée sur le risque, compte tenu des mauvais résultats associés au traitement antifongique inadéquat ou retardé; Méthodes Trois tests de réaction en chaîne de la polymérase en temps réel basés sur TaqMan ont été développés et permettent de détecter les principales espèces de Candida médicalement importantes, classées selon Probabilité d’une susceptibilité au fluconazole Test 1 détecté Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis et Candida dubliniensis Essais 2 et 3 détectés Candida glabrata et Candida krusei, respectivement La performance clinique de ces essais, appliquée au sérum, a été évaluée dans un essai prospectif de Adultes non neutropéniques dans une seule unité de soins intensifsRésultats Au total, 527 échantillons ont été obtenus auprès de 157 participants. Les 3 dosages ont été effectués en parallèle pour chaque échantillon; ils ont pu être complétés dans un délai d’un jour ouvrable. Parmi ceux-ci, 23 échantillons ont été obtenus chez 23 participants ayant une infection à Candida prouvée au moment du prélèvement. Si un seul épisode de Candida famata candidemia était exclu, la sensibilité clinique estimée, la spécificité et Les valeurs prédictives négatives des tests dans cet essai étaient respectivement de 909%, 100%, 100% et 998%. Conclusions Ces données suggèrent que les tests décrits donnent de bons résultats dans cette population pour améliorer le diagnostic de candidémie. , la pratique de prescription et la rentabilité des soins restent à déterminer

L’incapacité à traiter adéquatement une infection invasive à Candida – ou même à ne pas initier un traitement en temps opportun – a été associée à de mauvais résultats, y compris une mortalité accrue [1-3] Ceci, associé à la faible confiance des médecins dans les tests de routine avec un long délai temps, a favorisé la pratique de la prescription basée sur le risque [4-7] Une telle prescription préventive de médicaments, basée sur une colonisation anatomique extensive chez les patients à haut risque, réduit la probabilité d’un traitement antifongique inadéquat, mais au prix d’un surtraitement probable, avec les risques inhérents de toxicité inutile, de consommation de ressources et de sélection en faveur des organismes résistants. Par conséquent, le développement d’un outil de diagnostic performant, dans lequel les médecins pourraient avoir confiance, pourrait faciliter une approche plus ciblée de la prescription antifongique. les systèmes ont augmenté la sensibilité de détection à ~ 70% pour la candidose invasive, pas tous les laboratoires h ave a adopté toutes les mesures d’optimisation disponibles; la culture et l’identification subséquente peuvent nécessiter 48-96 h, et 5-7 jours doivent s’écouler avant qu’une hémoculture puisse donner des résultats négatifs [4, 8, 9] Techniques non culturales avec un temps de réponse plus court, comme la détection d’antigènes, d’anticorps et de métabolites , ont été étudiés Aucun n’a été accepté comme un outil de diagnostic idéal, et seulement quelques-uns ont été produits commercialement. [10-19] Certains systèmes de détection d’acide nucléique ont produit des résultats initiaux prometteurs dans des essais cliniques préliminaires; plusieurs ont des limites telles qu’une méthodologie lourde et un manque de vérification clinique robuste [20-31] Le but de cet essai était d’évaluer de manière approfondie les performances de 3 tests PCR en temps réel pour détecter des espèces communes de Candida directement à partir de spécimens cliniques. la population ciblée est celle dans laquelle le fardeau de la maladie est important, et les données de performance des tests moléculaires ont jusqu’à présent fait défaut

Méthodes

Conception d’oligonucléotides et tests de PCR

Conception d’amorces Les amorces utilisées dans le test 1 pour amplifier 4 espèces de Candida Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis et Candida dubliniensis et une sonde pour la détection d’amplicon ont été publiées précédemment [20, 32] des amorces pour Candida glabrata et Candida krusei. maison utilisant le logiciel Lasergene, version 5 DNAstar, pour les essais 2 et 3, respectivement le tableau 1; les sondes pour ces dosages ont déjà été publiées [32]. Les dosages étaient basés sur un ensemble de dosages à base de TaqMan à cycle unique rapportés précédemment par notre groupe [33]; Ces 3 essais ont été développés de manière à ce que le test 1 détecte le groupe des espèces sensibles au fluconazole C albicans, C tropicalis, C parapsilosis et C dubliniensis, alors que les tests 2 et 3 ont été détectés. C glabrata et C krusei, respectivement

Tableau 1View largeTélécharger la structure des oligonucléotides des amorces utiliséesTable 1View largeDownload slideOligonucléotide structure des amorces utiliséesAmplification PCR en temps réel deCandidaDNA amplification de première ronde a été réalisée sur 5 μL d’extrait ajouté à 20 μL du premier mélange maître, contenant 1 × Taq polymérase tampon Promega , 3 mmol / L de MgCl2, 02 mmol / L chacun de désoxynucléoside triphosphate dATP, dCTP, dGTP, dTTP; Promega, 02 umol / L de chaque amorce, et 05 U / mL de Taq ADN polymérase Promega Amplification a été effectuée comme suit: 1 cycle de 94 ° C pendant 3 min; 30 cycles de 94 ° C pendant 10 s, 58 ° C pendant 10 s et 72 ° C pendant 30 s; suivi d’un cycle de 72 ° C pendant 5 minUn aliquot 1 μL de produits de première ronde a été ajouté à 19 μL de master mix de second tour et a été traité comme décrit précédemment [33] dans un second cycle d’amplification pour obtenir des résultats imbriqués. amplification par PCR de l’ADN de Candida Les échantillons qui étaient positifs dans seulement 1 aliquote ont été répétés et, s’ils étaient réactifs, ont été considérés comme positifs pour la PCR.

Traitement et analyse des spécimens

Les échantillons de sérum ont été conservés à -20 ° C jusqu’à ce que les dosages soient effectués. Ensuite, 3 aliquotes de 400 ul de chaque échantillon de sérum ont été extraites avec le mini kit QIAamp DNA Qiagen avec 2 modifications. D’abord, ARN 10 ug / μL; Sigma-Aldrich a été ajouté au tampon de lyse à une concentration de 56 μg d’ARN / échantillon porteur immédiatement avant l’extraction. Deuxièmement, après élution de l’ADN, des micro concentrateurs YM-100 Millipore ont été utilisés pour augmenter la concentration d’ADN.

Conception et mise en place d’essais cliniques

Conception Un essai diagnostique observationnel prospectif a été réalisé pour vérifier ces tests dans l’unité régionale de soins intensifs d’Irlande du Nord. Il s’agit d’une unité de soins intensifs pour adulte de 24 lits et de soins intensifs qui reçoit environ 700 patients par an. L’essai a été mené en 2 étapes. L’étape 1 visait à évaluer la spécificité, la valeur prédictive positive PPV, et la valeur prédictive négative NPV des essais dans ce groupe gravement malade en testant toutes les maladies et les maladies. les personnes séropositives répondant aux critères d’entrée L’étape 2 a été conçue pour ajouter uniquement les personnes séropositives à la cohorte en sélectionnant des patients présentant une candidémie avérée; l’objectif était de rendre l’estimation de la sensibilité clinique plus robuste. Recrutement des participants et sélection des patients Les patients consécutifs admis à l’USI qui y sont restés pendant> 72 h pouvaient être inclus dans cet essai jusqu’à ce que 500 spécimens aient été recueillis. le patient ou son représentant légal L’une des raisons suivantes a été considérée comme une raison valable d’exclure des participants potentiels du recrutement: congés anticipés à l’USI ou retrait du traitement actif dans les 24 heures suivant le recrutement, neutropénie ou administration de médicaments antifongiques systémiques Au moment du recrutement ou au cours des 14 jours précédents.Durant le stade 1, des échantillons de sérum ont été prélevés prospectivement chez tous les participants recrutés deux fois par semaine. Chaque échantillon a été classé en fonction de la probabilité d’infection invasive à Candida chez le participant. jour de la collecte des échantillons rétrospective reclassifica Les catégories étaient fondées sur des paramètres cliniques et de laboratoire utilisant des définitions adaptées publiées par le groupe d’infections fongiques invasives EORTC de l’Organisation européenne pour la recherche et le traitement du cancer [34]. Les équipes cliniques ont été encouragées à mettre en évidence les participants «borderline» définis comme: ceux pour qui la catégorie d’infection la plus appropriée n’était pas claire

Tableau 2View largeTélécharger la diapositiveDéfinitions des catégories d’infections invasives à CandidaTableau 2View largeTélécharger la diapositiveDéfinitions de catégories d’infections invasives à CandidaStage 2 recrutement des participants et sélection des patients Les patients adultes consécutifs présentant une candidémie confirmée en laboratoire après l’étape 1 de l’essai étaient admissibles à l’étape 2. a été demandé au patient ou à son représentant légal Tous les échantillons ont été classés comme des infections prouvées. Analyse des résultats L’efficacité du groupe de tests Candida a été évaluée sur une base par échantillon par rapport à l’étalon de référence appliqué; Les paramètres évalués étaient la sensibilité clinique, la spécificité, la VPP et la VAN. La sensibilité clinique a également été évaluée par patient. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du progiciel de statistiques Stata, Stata PPV et VAN ont été évaluées sur la base des données du stade 1; La sensibilité clinique et la spécificité ont été évaluées sur la base des données regroupées des deux étapes. Sur la base de la sensibilité clinique du test de ⩾80%, acceptant des limites de confiance sur cette sensibilité de ⩽10% et des limites de confiance sur la spécificité de ⩽5%, Par conséquent, il a été décidé que lorsque le nombre de spécimens provenant de sujets séronégatifs atteindrait environ 500 individus désignés stade 1 de l’essai, seuls les spécimens provenant de la maladie seraient prélevés. les participants positifs seraient recueillis; cette période a été désignée étape 2 et s’est déroulée de la fin de la phase 1 jusqu’à la fin du mois 20

Résultats

Tests PCR

La sonde du test 1 s’hybridait de façon appropriée avec C albicans, C tropicalis, C parapsilosis et C dubliniensis, mais pas avec Candida famata, Candida kefyr, Candida guillermondii, Candida sphaerica, Candida lusitaniae, C krusei et C glabrata, ni avec d’autres bactéries. La sensibilité analytique des tests de PCR en temps réel a été déterminée comme décrit précédemment [33]. Le seuil de détection était de 10-10 pour le fluconazole. test de Candida sensible et 10-11 pour les dosages de C glabrata et de C krusei Le nombre de copies de point final pour chacun des 3 dosages était le suivant: test 1 dosage de Candida sensible au fluconazole, ~ 23 copies / mL; essai 2 C glabrata essai, ~ 056 copies / mL; et dosage 3 C krusei, ~022 copies / mL

Résultats des essais cliniques

Au cours de la première étape, 145 participants ont été recrutés, ce qui a permis de recueillir 515 spécimens. Au cours de la deuxième étape, 12 participants ont été recrutés, ce qui a permis de recueillir 12 spécimens. Aucun des participants n’a été classé comme «limite». 145 participants recrutés, 97 67% étaient des catégories diagnostiques du Centre national de recherche et de soins intensifs pour les maladies sous-jacentes à l’admission aux soins intensifs, les 3 catégories les plus fréquemment rencontrées étaient les traumatismes 37%, les maladies respiratoires 23% et les maladies gastro-intestinales 14% Le score APACHE II médian à l’admission était de 22, 7-37 participants au cours de la phase 1 totalisaient 2473 jours-lits aux USI. La durée médiane du séjour en USI était de 11 jours, 2-230 jours Cent-neuf participants 82% ont survécu Données sur l’infection fongique à l’admission aux soins intensifs pour les participants au stade 1 Parmi les 145 participants, 11 76% ont développé une infection invasive à Candida avérée et 6 41% ont développé infection probable avant le retrait de l’étude; les autres 128 participants 883% sont restés dans la catégorie de l’infection improbable partout Les 11 participants avec l’infection prouvée ont abouti à l’attribution de 11 spécimens à cette catégorie, et les participants avec l’infection probable ont abouti à l’attribution de 13 spécimens à cette catégorie; les 491 échantillons restants ont été classés dans la catégorie d’infection improbable Tous les participants ayant développé une infection invasive prouvée à Candida au stade 1 de l’essai avaient une candidémie documentée: 9 avec albicans C, 1 avec C glabrata et 1 avec C famataPCR résultats d’analyse de l’étape 1 Aucun des 491 échantillons attribués à la catégorie improbable n’était positif à la PCR Trois des 23 échantillons de la catégorie probable étaient positifs à la PCR; tous les 3 ont été obtenus d’un participant qui a ensuite développé une candidémie documentée. Les 11 échantillons attribués au groupe prouvé provenaient de participants présentant une candidémie confirmée en laboratoire. Neuf 82% étaient positifs à la PCR; 1 spécimen PCR-négatif avait été obtenu chez un participant avec C albicans candidemia, et 1 avait été obtenu chez un patient avec C famata candidemia Le moment de l’échantillonnage PCR en référence à l’échantillonnage sanguin qui a abouti à une culture positive résulte dans le groupe éprouvé Les deux échantillons PCR négatifs ont tous deux été prélevés à 1 jour. Données sur l’infection fongique pour les participants au stade 2 Tous les 12 échantillons prélevés provenaient de 12 participants qui avaient une candidémie documentée. Parmi ceux-ci, 9 avaient une candidémie due au C. albicans. candidémie due à C glabrata, et 1 avait une candidémie mixte avec les résultats du test C albicans et C glabrataPCR du stade 2 Onze 917% des 12 échantillons étaient positifs à la PCR; cependant, le participant présentant une candidémie mixte était positif uniquement avec le test 1 groupe C albicans mais pas le test C glabrata Le test PCR négatif était pour un participant avec C albicans candidémie Le moment de l’échantillonnage PCR en référence à l’échantillonnage sanguin qui a donné des résultats de culture positifs allant de 0 jours à 7 jours. L’échantillon PCR négatif a été obtenu le même jour que l’échantillon d’hémoculture positif.

Rendement du test

Sur la base d’une analyse par échantillon des épisodes d’infection avérés et improbables seulement, la sensibilité clinique du groupe de tests PCR était de 87% 909% si l’épisode C famata était exclu; 20 des 23 échantillons provenant de participants de la catégorie d’infection prouvée ont été testés positifs au tableau 3 Sur la base d’une analyse par patient, l’estimation de la sensibilité clinique était identique La spécificité clinique était de 100%; aucun spécimen de participants de la catégorie d’infection improbable n’a été testé positif. Le VPP, basé sur les données du stade 1, était de 100%. La VAN était de 996%; Si l’infection à C famata est exclue, elle passe à 998%

Récapitulatif des analyses de performance du test Si les participants de la catégorie d’infection probable étaient supposés être réellement positifs pour la maladie et incorporés dans l’analyse par spécimen, la sensibilité et la VAN des tests diminueraient jusqu’à 64% et 98%, respectivement, bien que la spécificité et la VPP ne soient pas affectées L’inclusion de ces 6 participants dans l’analyse par patient réduirait l’estimation de la sensibilité du test à 72%

Discussion

y en pratique clinique; par conséquent, bien que cette approche soit utile pour la validation du test, leur performance peut être différente si elle est adoptée dans des algorithmes de diagnostic. Le présent essai a été conçu pour surmonter certaines des lacunes du travail précédent rapporté; néanmoins, les résultats doivent être interprétés avec prudence. Par exemple, moins de spécimens de la catégorie éprouvée ont été collectés que prévu; Cela a réduit la précision des estimations de sensibilité et de VPP. Deuxièmement, le travail était basé sur un seul centre, bien que les scores APACHE II et les taux de survie dans la cohorte étaient similaires à ceux d’un audit à l’échelle du Royaume-Uni. les définitions étaient basées sur des définitions consensuelles approuvées par l’EORTC pour une utilisation dans des essais cliniques, avec des adaptations pour les rendre plus applicables aux adultes non neutropéniques. Tableau 2 L’absence de définitions de maladies disponibles précédemment validées pour les adultes non neutropéniques limite quelque peu ces données; Bien que la définition de l’infection prouvée ne soit pas contestée, la définition de l’infection probable dans cette population présente des difficultés. Il est presque impossible de juger si les participants affectés à cette catégorie doivent être considérés comme En effet, les définitions étant basées sur des modèles de décisions thérapeutiques communément utilisées, qui sont biaisées vers le surtraitement. Pour cette raison, et comme seulement 6 participants ont été répartis dans cette catégorie, l’analyse a été réalisée avec et sans ce groupe. En effet, devenue l’étalon de référence, l’interprétation des données du groupe d’infection probable devient encore plus incertaine. Vu la taille de l’échantillon positif pour la maladie recruté dans cet essai, le spectre des espèces de Candida impliquées dans la maladie observée était limité. un épisode de candidémie mixte s’est produit dans cet essai; cela impliquait C glabrata et C albicans. Seule C albicans a été détectée par les tests dans ce spécimen. L’explication de ceci n’est pas claire; il est possible que la charge de C glabrata soit inférieure au seuil de détection du test et que la charge de C albicans soit plus élevée, mais une explication alternative peut exister. Au cours de la dernière décennie, plusieurs essais ont rapporté la détection directe d’ADN fongique Oliveira et al [24] ont évalué un test de PCR dans un groupe hétérogène de 225 patients hospitalisés à haut risque. Lorsque l’hémoculture était utilisée comme étalon de référence, la performance était décevante avec une sensibilité de 72%, une spécificité de 91% et une VPP de 66 %, et VAN de 93%; Notons que notre analyse principale utilise efficacement les hémocultures comme étalon de référence. Un autre test en temps réel spécifique de C albicans ayant adopté la technologie TaqMan a été décrit par Maaroufi et coll. [29] Malheureusement, la spécificité clinique du test n’a pu être déterminée. Ce test ne permettait pas de détecter d’autres espèces de Candida que l’albicans de C. L’étude de Klingspor et Jalal [23] comprenait un grand échantillon de patients mais, encore une fois, l’analyse des données était gravement compromise par le manque d’informations cliniques. l’essai décrit ici est unique à bien des égards et, par conséquent, des comparaisons de données fiables sont difficiles; cependant, comparés aux données publiées disponibles dans lesquelles la candidémie a été utilisée comme étalon de référence, ces tests ont montré de très bonnes performances. Néanmoins, la précision avec laquelle les mesures de performance ont été estimées dans cet essai serait améliorée par une évaluation avec un échantillon plus grand. De plus, des preuves d’applicabilité multicentrique ajouteraient du poids à l’utilité clinique des tests. De plus, étant donné que tous les patients avec une infection prouvée dans cette série de données présentaient une candidémie, ces données n’évaluent pas la performance du test dans les infections invasives non Candida. les critères d’exclusion adoptés peuvent expliquer la sous-représentation de ce dernier; ces patients sont susceptibles d’avoir reçu un traitement antifongique préventif et ont donc été exclus de l’essai avant de répondre à la définition de cas d’infection prouvée. Certaines questions économiques de santé importantes doivent également être traitées avant l’adoption généralisée de tels outils moléculaires dans le diagnostic de routine. Cette technique et d’autres similaires n’ont pas été correctement évaluées. Il sera de plus en plus difficile de justifier l’ajout de tests séquentiels à la voie diagnostique de routine si les méthodes de diagnostic moléculaire ne remplacent pas les techniques conventionnelles. En résumé, ces données suggèrent que les dosages décrits peuvent donner de bons résultats pour le diagnostic rapide de la candidémie chez les adultes non neutropéniques. Les tests montrent une sensibilité élevée, une excellente spécificité et des résultats potentiellement disponibles le même jour.

Remerciements

Soutien financier Ce travail a été soutenu par le Bureau de recherche et de développement des services sociaux et de santé de l’Irlande du Nord dans le cadre du plan d’action sur la résistance aux antimicrobiens. Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit